微⽣物学实验室规则
医学微⽣物学实验的对象⼤多为病原微⽣物，具有传染性，因此要求进⼊实验室后必须严格遵守以下实验室规则：
1．进⼊实验室应穿⽩⼤⾐，离室时脱下，反折放回原处，不必要的物品不得带⼊实验室，必须带⼊的书籍和⽂具等应放在指定的⾮操作区，以免受到污染。⽆菌操作时必须戴⼝罩，并不得开电风扇。 高见光
2．实验室内禁⽌饮⾷、抽烟，不得⾼声谈笑或随便⾛动。
3．各种实验物品应按指定地点存放，⽤过的器材必须放⼊消毒缸内，禁⽌随意放于桌上及冲⼊⽔槽。
4．须送温箱培养的物品，应做好标记后送到指定地点。
5．实验过程中发⽣差错或意外事故时，禁⽌隐瞒或⾃作主张不按规定处理，应⽴即报告⽼师进⾏正确的处理。如有传染性的材料污染桌⾯、地⾯等，应⽴即⽤0. 2%~0. 5% “84”
消毒液浸泡污染部位，作⽤5～10min后⽅可抹去。如⼿被活菌污染也应使⽤上述消毒液浸泡5～10min后，再以⾃来⽔反复冲洗⼲净。
6．爱护室内仪器设备，严格按操作规则使⽤。节约使⽤实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告⽼师进⾏处理。
7．实验完毕，应物归原处并将桌⾯整理清洁，实验室打扫⼲净。最后以0.2%~0. 5% “84”
消毒液浸泡⼿5min，洗净后⽅可离开实验室。
第⼀篇微⽣物学实验基本技术
第⼀章常⽤仪器及⽆菌室简介磨床磨削液
实验1常⽤仪器及⽆菌室简介
微⽣物学是⼀门实验性很强的医学基础学科，微⽣物学实验教学在整个微⽣物学的教学过程中占有很⼤的⽐重。所以有必要加强微⽣物学的实验教学⼯作。⽽要搞好微⽣物学的实验教学，必需具备⼀些基本实验条件。本部分简要介绍微⽣物学实验的⼀些常⽤仪器和其它基本实验条件。
（⼀）⾼压蒸⽓灭菌器
5-氯-2-戊酮
1．构造及原理：此种灭菌器为⼀个双层的⾦属圆筒，两层之间盛⽔。外层为坚厚的⾦属板，其上有⾦属厚盖，盖旁有螺旋，借以扣紧厚盖，厚盖与锅体之间为密封圈，使蒸⽓不能外溢。加热后，随着锅内蒸⽓压⼒的升⾼，其温度也相应增⾼，从⽽达到使待灭菌物品灭菌的⽬的。锅内蒸⽓压⼒与锅内温度的关系如表1-1 表1-1 不同蒸⽓压⼒所能达到的温度
蒸⽓压⼒
温度（℃）磅/平⽅厘⽶公⽄/平⽅厘⽶kPa
50.3533.78108.8
80.5754.04113.0
100.7067.55115.6
15 1.0101.33121.3
20 1.46135.10126.2
25 1.77168.88130.4
30 2.10202.66134.6
⾼压蒸⽓灭菌器盖上装有排⽓阀、安全阀，以调节灭菌器内蒸⽓压⼒。有温度计及压⼒表，以指⽰灭菌器内部的温度和压⼒。灭菌器内装有带孔的⾦属搁板，⽤以放置待灭菌物品。
⾼压蒸⽓灭菌器的外形结构如图1-1
2．使⽤⽅法
（1）在外层锅内加适量的⽔，将需要灭菌的物品放⼊内层锅，盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。（2）加热使锅内产⽣蒸⽓，当压⼒表指针达到 33.78kPa时，打开排⽓阀，将冷空⽓排出，此时压⼒表指针下降，当指针下降⾄零时，即将排⽓阀关好。
（3）继续加热，锅内蒸⽓增加，压⼒表指针⼜上升，当锅内压⼒增加到所需压⼒时，将⽕⼒减⼩，按所灭菌物品的特点，使蒸⽓压⼒维持所需压⼒⼀定时间，然后将灭菌器断电或断⽕，让其⾃然冷后再慢慢打开排⽓阀以排除余⽓，然后才能开盖取物。抗石击涂料
3．注意事项：
（1）待灭菌的物品放置不宜过紧。
（2）必须将冷空⽓充分排除，否则锅内温度达不到规定温度，影响灭菌效果。
（3）灭菌完毕后，不可放⽓减压，否则瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞⽽外溢甚⾄导致容器爆裂。须待灭菌器内压⼒降⾄与⼤⽓压相等后才可开盖。
（4）装培养基的试管或瓶⼦的棉塞上，应包油纸或⽜⽪纸，以防冷凝⽔⼊内。
（5）为了确保灭菌效果，应定期检查灭菌效果，常⽤的⽅法是将硫磺粉末（熔点为115℃）或安息⾹酸（熔点为120℃）置于试管内，然后进⾏灭菌试验。如上述物质熔化，则说明⾼压蒸⽓灭菌器内的温度已达要求，灭菌的效果是可靠的。也可将检测灭菌器效果的胶纸（其上有温度敏感指⽰剂）贴于待灭菌的物品外包装上，如胶纸上指⽰剂变⾊，亦说明灭菌效果是可靠的。
（6）现在已有微电脑⾃动控制的⾼压蒸⽓灭菌器，只需放去冷⽓后，仪器即可⾃动恒压定时，时间⼀到则⾃动切断电源并鸣笛，使⽤起来很⽅便。
4．应⽤：为最常⽤的灭菌⽅法，⼀般以 101.33kPa处理15～20min，可达到对物品进⾏灭菌的⽬的。凡耐⾼温和潮湿的物品，如常⽤培养基、⽣理盐⽔、⾐服、纱布、玻璃器材等都可⽤本法灭菌。
（⼆）电热恒温⼲燥箱（烤箱）
1．构造及原理：电热恒温⼲燥箱俗称烘箱或烤箱，主要由箱体、电热器和温度控制器三部分组成，其外形如图1-2。
（1）箱体：箱体由箱壳、箱门、恒温室、进⽓孔、排⽓孔和侧室组成。箱壳⽤薄铁（钢）板制成，箱壁⼀般分为三层，三层板之间形成内外两个夹层。外夹层中⼤多填充玻璃纤维或⽯棉等隔热材料；内夹层作为空⽓对流层。烤箱的箱门均为双层门，内门为玻璃门，⽤于在减少热量散失的情况下观察所烘烤物品。外门⽤于隔热保温。最内层铁（钢）板所围绕成的室叫作恒温室，室内⼀般有2～3层⽹状搁架，⽤于放置物品。
温度控制器的感温部分从左侧壁的上部伸⼊恒温室内，底部夹层中装有电热丝，在箱体的底部或侧⾯和顶部各有⼀进、排⽓孔，在排⽓孔中央插⼊⼀⽀温度计，⽤以指⽰箱内的温度。侧室⼀般设在箱体的左边，与恒温室隔热隔开，除了电热丝外的所有电器元件，如开关、指⽰灯、温度控制器、⿎风机等均安装在侧室内，打开侧室门可以很⽅便地检修电路。
（2）电热丝：电热恒温⼲燥箱的电热丝通常由四根并联⽽成，与普通电炉相似，电热丝均匀地盘绕在耐⽕材料烧成的绝缘板上，电热丝的总功率⼀般在1～8KW之间。
（3）温度控制器：⼲燥箱内的温度是由温度控制器控制的，其基本原理是当恒温箱内的温度超过所需温度时，温度调节器就使电路中断，加热⾃动停⽌；当温度低于所需温度时，电路⼜恢复，温度即
上升。
负离子加湿器
图1-1⾼压蒸⽓灭菌器图1-2 电热恒温⼲燥箱
2．使⽤⽅法：待灭菌的物品充分⼲燥，包装好后，将其置烤箱内，闭门通电，待温度上升⾄160～180℃后，保持2h即可。3．注意事项：
（1）待灭菌的玻璃器材必须充分⼲燥，否则耗电过多，灭菌时间长，且玻璃器材有破裂的危险。
（2）灭菌温度不要超过180℃，否则棉花及纸将被烧焦。
（3）灭菌后必须等箱内温度下降⾄与外界温度差不多时，⽅可打开箱门，否则冷空⽓突然进⼊，玻璃器材极易破裂，且有引起纸和棉花起⽕的危险，另外箱内的热空⽓溢出，易导致操作者⽪肤灼伤。
（4）箱内物品放置不宜过紧，否则灭菌效果下降，且易引起危险。
4．应⽤：凡耐⾼温⽽且需要⼲燥的物品如玻璃器材、⾦属器械等（⼿术器械及针头例外），
可⽤此法灭菌。
⼆、滤菌器
1．构造及种类：滤菌器由孔径极⼩且能阻挡细菌通过的陶瓷、硅藻⼟、⽯棉或玻璃沙等制成。种类很多，常⽤的有下列⼏种：
（1）赛⽒（Seitz）滤菌器（图1-3a）：由三部分组成。上部为⾦属圆筒，⽤以盛装需要过滤除菌的液体，下部为⾦属托盘及漏⽃，⽤以接受滤出的液体；上下两部分中间放⽯棉制的滤板，滤板孔径⼤⼩可分三种：K滤孔最⼤，供澄清液体之⽤；EK 滤孔较⼩，供滤过除菌；EK-S滤孔更⼩，可阻⽌⼀部分较⼤的病毒通过。滤板依靠侧⾯附带的紧固螺旋拧紧固定。
（2）贝克菲滤菌器（图1-3b）：⽤硅藻⼟加压制成的空⼼圆柱体，底部连接⾦属托盘，托盘中央有⾦属导管，⾦属导管插⼊橡胶塞，以便装在抽⽓瓶上，在圆柱体外，有玻璃套筒，⽤以盛放被滤液体。根据滤孔孔径⼤⼩可分为三型：V型，只除去⼤部分细菌；
N型，能除去所有细菌，但病毒能通过；W型，能除去⼀部分⼤病毒；⼀般除菌使⽤N 型。
（3）玻璃滤菌器（图1-3c）：由玻璃制成。滤板采⽤细玻璃砂在⾼温下加压制成。孔径由
0.15～250µm不等，分为G1、G2、G3、G4、G5、G6六种规格，后⼆种能阻挡细菌通
过。
（4）薄膜滤菌器（图1-3d）：由塑料制成。滤菌器薄膜采⽤优质纤维滤纸，⽤⼀定⼯艺加压制成。孔径200nm。能阻挡细菌通过。
2．⽤法：将清洁的滤菌器（赛⽒滤菌器、薄膜滤菌器须先将⽯棉板、或滤菌薄膜放好，螺旋拧牢）、滤瓶分别⽤纸或布包装好，⾼压蒸⽓灭菌。再以⽆菌操作把滤菌器与滤瓶装好，并使滤瓶的侧管与缓冲瓶相连，再使缓冲瓶与抽⽓机相连。将待过滤液体倒⼊滤菌器中，开动抽⽓机使滤瓶中压⼒减低，滤液则徐徐流⼊滤瓶中（量少时可事先在滤瓶中放试管接收滤液）。滤毕，迅速按⽆菌操作将滤瓶中的滤液放到⽆菌容器内保存。滤器经⾼压蒸⽓灭菌后，洗净备⽤。
3．⽤途：⽤于除去⾎清、腹⽔、溶液、某些药物等不耐热液体中污染的细菌。
三、恒温箱（温箱）
1．构造及原理：结构因种类不同⽽异，有的是以热空⽓加温，也有以⽔浴加温的。其温度是依靠温度调节器来维持的，温度调节器有各种类型；如定温膨胀温度调节器、双合⾦式温度调节器和⽔银式温度调节器，基本原理同电热恒温⼲燥箱。在⼤型实验室可设恒温室。
2．应⽤：常⽤于⼈⼯培养细菌。⼀般病原微⽣物以36～37℃为最适宜。
天燃气燃烧机四、冰箱
根据冰箱温度的⾼低，分为普通冰箱（家⽤冰箱）及低温冰箱。前者维持温度⼀般在0～5℃之间，其冷藏室内可达零下20℃；后者的温度可达零下50～90℃。
冰箱主要⽤于保藏菌种、⾎清、培养基及其它⽣物制品。
a b
c d
图1-3 各种滤菌器
五、液氮罐
即储存液氮的容器。液氮罐具有良好的隔热性能，可避免液氮在短时间内⽓化，从⽽使罐内较长时间地保持在低温状态（-196℃）（图1-4）
主要⽤于组织细胞、菌种、病毒及⽣物制品等的长期保藏。
六、恒温⽔浴箱（⽔浴箱）
⼀般为⾦属制的长⽅形箱，箱体为两层壁结构，外壳⽤薄钢板，内壁⽤铜⽪制成，夹层中充以隔热材料以防散热。箱内盛⽔，⽤电热维持温度，通常可⾃37℃调节⾄65℃（有的可⾄100℃），温度控制器通常采⽤螺旋管式。侧室⼀般位于其右边。箱盖呈斜⾯，以便于⽔蒸⽓所凝成的⽔滴沿斜⾯流下，避免落⼊箱内的物品中（图1-5）。
此仪器⼀般⽤作⾎清学反应及分⼦微⽣物学实验时加温及恒温⽤。
图1-4 液氮罐图1-5 电热恒温⽔浴箱
七、厌氧培养箱
1．构造及原理
厌氧培养箱主要是利⽤密封、抽⽓、换⽓及化学除氧⽅法造成厌氧状态，有利于厌氧菌的⽣长繁殖。厌氧培养箱装有真空表、真空泵⽓阀、温度控制器、总电源指⽰灯、六个培养罐⽓阀。箱内装有远红外线加热器、需氧培养槽以及六个培养罐体(图1-6)。
2．⽓体纯度与⽓体分配：
（1）纯度要求：厌氧菌培养所⽤⽓体纯度需达99.99%以上。
（2
3．⼲燥剂与脱氧剂：
①⾼效⼲燥剂分⼦筛3A。
②105型脱氧催化剂（钯粒）。
4．指⽰剂：
①厌氧环境指⽰剂：美蓝溶液。
②CO
2
环境指⽰剂：溴麝⾹草酚兰。
5．操作⽅法
①⾸先将所有⽓阀全部关闭。开启真空泵阀，再开启A罐体阀，将A罐体门敝开。
②迅速将已接种细菌的培养基放⼊罐内，同时将105型脱氧催化剂约50g与⾼效⼲燥剂分
⼦筛3A约15g混合后放⼊2只不加盖玻璃⽫内，⽽后放⼊A罐内。
③将预先备好的厌氧环境指⽰剂放⼊罐门真空玻璃前（以利于观察颜⾊变化），迅速关闭
罐门、扭紧。
④开动真空泵，当真空达到700mmHg时，将泵阀门关闭后，再关停真空泵电源。
⑤开启输⽓总阀（即输N
2、H
2
、CO
2
），开启⽓体盘铜阀（N
2
阀），⽤N
2
冲洗罐床及管路，
轻轻开启N
2
瓶阀及减压器阀。
⑥当真空表针由700mmHg回复到0位时，关闭N
2
铜阀，再开启真空泵阀，按上述操作重复⼀次，以除去残余氧⽓。
⑦再按“4、5”操作，按需要⽐例通⼊N
2、H
2
、CO
2
。
⑧真空表指针回复到0位时，即将铜瓶阀门关闭，再次检查，所有⽓阀需⼀律关闭。
⑨在已放有接种之培养基的罐门上，挂⼀标牌，注明放物⽇期，并在化验单上也注明罐体号。⼋、⼆氧化碳培养箱
CO
2培养箱种类繁多，其核⼼部分是CO
2
调节器、温度调节器及湿度调节装置，⼀般温
度调节范围为室温⾄50℃，湿度在95%以上，CO
2
控制范围为0～20%，当空⽓进⼊箱内后，
通过能产⽣潮湿的含⽔托盘，⽤CO
2调节装置调节CO
2
的张⼒，或者将空⽓和CO
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