一种牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器及其制备方法

1.本发明涉及医疗器械技术领域，具体是一种牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器及其制备方法。

背景技术：

2.牙周炎是一种以牙及其支持组织损害为特征的全球第六大慢性炎症性疾病，其不仅影响口腔健康还与一些全身系统性疾病密切相关。由于疾病的早期无明显的临床症状，易使患者错过的最佳时期而造成永久性损害。因此牙周炎的早期诊断和监测对于疾病的预防和控制十分重要。然而，传统的临床诊断方法(如视诊、探诊和影像学检查)操作困难，费用高昂，并且只能反映牙周炎的累积破坏情况而不能反映疾病的现状，更不能监测牙周炎的进展情况。因此急需开发一种新的，操作简单，费用低廉的牙周炎诊断方法。
3.近年来，牙周炎相关生物标志物已被广泛用来反映疾病的现状、预测疾病的进展以及预后情况。基质金属蛋白酶-8(mmp-8)和促炎细胞因子白细胞介素-1β(il-1β)是存在于唾液、和龈沟液等口腔液体中最典型的牙周炎生物标志物。重要的是，与健康人相比它们的水平明显升高并随着牙周损害的进展和而变化。其中，mmp-8和il-1β的水平在牙周炎的早期就显著提高，il-1β还以剂量依赖的方式与牙周炎晚期相关。实际上，已有大量研究表明多种生物标志物同时检测对疾病的诊断更加可行。另外，与龈沟液相比，唾液的收集是一种更加方便、非侵入性、不受血液污染、不需要专业人员的方法。
4.因此，同时检测唾液中mmp-8和il-1β的浓度对于准确诊断牙周炎的严重程度和监测牙周炎的进展是必要的。然而，生物标志物在唾液中的水平较低，并含有一些干扰物质。因此高灵敏度和特异性的唾液多标志物联合检测仍然面临着巨大的挑战。
5.目前在临床研究中，唾液生物标志物的检测通常是通过酶联免疫吸附试验和免疫荧光试验进行的。这些方法存在设备昂贵、试剂消耗量大、效率低下，不便于椅旁操作等缺点。近年来微流控技术因其高容积率、低样品消耗并且可以集成其他功能元件的特点被认为是最有前途的临床诊断平台之一。另一方面，在将生物化学信息转换为可测量信号的各种策略中，电化学方法因其高灵敏度和低检测限的特点脱颖而出，并且不同大小和型号的电极也很易集成到微流控芯片中。因此微流控技术和电化学传感技术相结合是一种有吸引力的诊断分析平台，尤其是以poct的方式进行疾病诊断和监测。
6.随着材料学和传感技术的发展，目前已有一些实验室层面上用于诊断牙周炎的生物传感器。然而这些生物传感器要么只能检测单一生物标志物，对疾病的诊断不够可靠；要么是使用纸基传感器，通过颜的变化来判断疾病情况，检测的灵敏度有限；要么是只能在实验室使用，不利于操作和椅旁检测。据我们所知，目前还没有一种微流控电化学免疫传感器能够以poct的方式高灵敏度和特异性的同时检测唾液中多种生物标志物，用于诊断和监测牙周炎。

技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，包括：
10.微流控芯片；
11.平面型免疫传感件，安装在所述芯片件上，所述平面型免疫传感件包括：
12.mmp-8免疫传感器；
13.il-1β免疫传感器，用于配合mmp-8免疫传感器通过唾液对牙周炎进行早期诊断和监测。
14.作为本发明的进一步技术方案，所述mmp-8免疫传感器通过如下方法制备而成：
15.合成氧化铱碳化钛复合纳米材料；
16.将丝网印刷电极用去离子水清洗并在室温下干燥；
17.将合成氧化铱碳化钛复合纳米材料与壳聚糖超声混合均匀，然后取混合溶液滴加在丝网印刷电极上，并在红外灯下干燥；
18.将红外烘干的电极在室温下浸泡在戊二醛水溶液中，然后用去离子水冲洗；
19.将冲洗后的电极浸入mmp-8抗体溶液中，孵育后用生物缓冲液冲洗电极表面；
20.将用生物缓冲液冲洗后的电极与牛血清白蛋白溶液孵育，完成后用生物缓冲溶液冲洗，然后储存在生物缓冲液中备用。
21.作为本发明的更进一步技术方案，所述il-1β免疫传感器采用如下方法制备而成：
22.合成氧化铱碳化钛复合纳米材料；
23.将丝网印刷电极用去离子水清洗并在室温下干燥；
24.将合成氧化铱碳化钛复合纳米材料与壳聚糖超声混合均匀，然后取混合溶液滴加在丝网印刷电极上，并在红外灯下干燥；
25.将红外烘干的电极在室温下浸泡在戊二醛水溶液中，然后用去离子水冲洗；
26.将冲洗后的电极浸入il-1β抗体溶液中，孵育后用生物缓冲液冲洗电极表面；
27.将用生物缓冲液冲洗后的电极与牛血清白蛋白溶液孵育，完成后用生物缓冲溶液冲洗，然后储存在生物缓冲液中备用。
28.作为本发明的再进一步技术方案，所述合成氧化铱碳化钛复合纳米材料为：通过自上而下的选择性蚀刻合成碳化钛纳米片，用静电纺丝工艺合成氧化铱纳米管。
29.作为本发明的再进一步技术方案，所述壳聚糖的质量浓度为1％；所述戊二醛水溶液的质量浓度为1％，浸泡时间为30min。
30.作为本发明的再进一步技术方案，所述牛血清蛋白溶液的质量浓度为1％。
31.作为本发明的再进一步技术方案，所述微流控芯片包括：
32.芯片件；
33.进样件，与所述芯片件相连，用于提供检测样品；
34.出样管，一端与所述检测池相连，用于将检测池内的样品送出。
35.作为本发明的再进一步技术方案，所述芯片件包括：
36.芯片基层，开设有两个电极固定槽；
37.芯片顶层，开设有检测池和液体微通道，所述检测池通过液体微通道与进样件相连，用于接收进样件提供的样品并使样品与平面型免疫传感件发生反应；
38.芯片固定螺钉，用于将芯片顶层和芯片基层与平面型免疫传感件连接固定。
39.作为本发明的再进一步技术方案，所述进样件包括：
40.样品进样管；
41.pbs缓冲液进样管；
42.氧化还原对进样管。
43.一种如上述所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
44.制备mmp-8免疫传感器；
45.制备il-1β免疫传感器；
46.制备微流控芯片；
47.将mmp-8免疫传感器和il-1β免疫传感器组装在微流控芯片上即得。
48.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
49.1、对牙周炎的早期诊断和监测具有重要意义，解决了传统检测方法中费用昂贵，需要专业人员，操作复杂，不利于椅旁操作等问题；
50.2、利用微流控装置将唾液样品输送到检测池中，待样品与检测池中装配的mmp-8免疫传感器和il-1β免疫传感器反应后，根据电流信号得出患者牙周健康状况结果；
51.3、操作简单，试剂消耗量少，方便快速，是一种非侵入性的早期牙周炎诊断方法；
52.4、为未来poct的方式预测牙周炎进展、指导牙周炎铺平了道路。
附图说明
53.图1为免疫传感器的爆炸图；
54.图2为制备的氧化铱纳米管碳化钛纳米片(iro
x
/ti3c2t
x
)复合材料形貌图；
55.图3为制备的iro
x
/ti3c2t
x
复合材料表面形貌分析图；
56.图4为免疫传感器的电化学性能和实验条件的优化图；
57.图5为平面型免疫传感器的制作过程及微流控免疫传感器用于牙周炎的早期诊断和监测示意图；
58.图6为免疫传感器性能研究图。
59.图中：1-进样件、11-样品进样管、12-pbs缓冲液进样管、13-氧化还原对进样管、2-芯片固定螺钉、3-芯片顶层、4-液体微通道、5-平面型免疫传感件、51-mmp-8免疫传感器、52-il-1β免疫传感器、6-芯片基层、7-电极固定槽、8-工作电极、9-检测池、10-出样管。
具体实施方式
60.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
61.本发明实施例是这样实现的，如图1所示的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，包括:
62.微流控芯片；
63.平面型免疫传感件5，安装在所述芯片件上，所述平面型免疫传感件5包括：
64.mmp-8免疫传感器；
65.il-1β免疫传感器，用于配合mmp-8免疫传感器通过唾液对牙周炎进行早期诊断和监测。
66.本发明在实际应用时，通过mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52配合工作电极8来检测唾液，从而实现对牙周炎进行早期诊断和早期监测，两个的标志物不同，两个监测更全面和准确；根据电流信号得出患者牙周健康状况结果；操作简单，试剂消耗量少，方便快速，并且是一种非侵入性的早期牙周炎诊断方法，为未来poct的方式预测牙周炎进展、指导牙周炎铺平了道路。
67.具体的，mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52通过如下方法制备而成：
68.合成氧化铱碳化钛复合纳米材料：丝网印刷电极(spes)工作电极8表面均用氧化铱纳米管和碳化钛纳米片(iro
x
/ti3c2t
x
)复合材料来放大传感信号；二维ti3c2t
x nss通过自上而下的选择性蚀刻过程合成，氧化铱纳米管(iro
x nts)通过静电纺丝工艺获得；因其分别带负电和正电，所以通过静电吸附作用可以得到稳定的氧化铱碳化钛复合纳米材料复(iro
x
/ti3c2t
x
)；
69.将丝网印刷电极(spes)用去离子水清洗并在室温下干燥；
70.将iro
x
/ti3c2t
x
复合纳米材料与1wt％的壳聚糖(cs)超声混合均匀，然后取5μl上述混合溶液滴加在spes的工作电极8上，并在红外灯下干燥；
71.将红外干燥后的电极室温下浸泡在质量1％的戊二醛(ga)水溶液中30min，以活化cs表面的氨基，从而偶联抗体(ab)；然后用去离子水冲洗改性的spe电极以去除多余的ga分子；
72.将去除ga的电极分别浸入3.12μg/ml的mmp-8抗体溶液和6.25μg/ml的il-1β抗体溶液中，在4℃下孵育12h后用生物缓冲液(pbs)冲洗电极表面以去除未结合的抗体和物理吸附；
73.将生物缓冲液冲洗后的电极与质量1％的牛血清白蛋白(bsa)溶液在37℃下孵育1h，以进一步封闭电极表面的非特异性活性位点，反应完成后用生物缓冲溶液冲洗，去除电极表面多余的bsa，相应的mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52在不使用时被储存在4℃的pbs溶液中。
74.进一步的，碳化钛纳米片(ti3c2t
x nss)的制备如下(具体见图2，其中：a为多层ti3c2t
x nss扫描电镜图，b为少层ti3c2t
x nss的透射电镜图，c为iro
x nts扫描电镜图,d为iro
x nts的透射电镜图,e为iro
x
/ti3c2t
x
复合材料的扫描电镜图,f为iro
x
/ti3c2t
x
复合材料的透射电镜图(白和灰箭头分别为iro
x nts和ti3c2t
x nss)，g为iro
x
/ti3c2t
x
复合材料的扫描透射电镜图，ha-hd为ir、o、ti和c元素的相应能量散x射线光谱图)：
75.二维ti3c2t
x nss是通过自上而下的选择性蚀刻程序合成的。
76.1)多层ti3c2t
x
的制备：首先将2g氟化锂(lif)加入到20ml 9m的稀盐酸中(由浓盐酸稀释)，并用磁力搅拌器搅拌；然后将1g ti3alc2粉末缓慢地分散在上述溶液中，并在35℃搅拌24h形成均匀的悬浮液；随后用去离子水和乙醇将颗粒洗涤4次，直到上清液的ph值约为6，此时得到多层ti3c2t
x
，材料的形貌图如图2a所示。
77.2)少层ti3c2t
x
的制备:将混合物稀释到200ml并超声处理1h，之后以3500rpm/min
的速度离心收集上清液；将胶体溶液在孔径为20nm的多孔膜上进行真空过滤，将得到的固体在40℃下干燥8小时，即得到少层的ti3c2t
x nss粉末，材料的形貌图如图2b所示。
78.氧化铱纳米管(iro
x nts)的制备：iro
x nts通过静电纺丝工艺获得。
79.1)前驱体溶液的制备：首先称量0.25g的水合三氯化铱(ircl3·
xh2o)加入到2ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，在80℃的水浴锅中磁力搅拌10min，然后将0.4g的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)(mw＝1300000)加入到上述混合的溶液中，继续磁力搅拌，直至得到透明的电纺前驱体溶液。
80.2)静电纺丝参数设置：将制备好的前躯体溶液装入5ml的塑料注射器中进行电纺，用内径为0.8mm的不锈钢针头作为电纺的喷丝头，将铝箔覆盖在滚轮上作为接收板；喷丝头和接收板距离为17cm，注射速度为0.05mm/min，正负电压分别为18kv和-1kv。
81.3)iro
x
管状结构的制备：电纺所得的膜在干燥塔中干燥12h后，将其放在马弗炉中以1℃/min的加热速度从室温加热到500℃煅烧3h，以去除pvp纳米纤维模板并使iro
x
结晶，然后炉子自然冷确到室温，煅烧得到的产物即为iro
x nts，材料的形貌图如图2c,2d所示。
82.(3)氧化铱碳化钛复合材料(iro
x
/ti3c2t
x
)的制备：将iro
x nts和ti3c2t
x nss在水中混合并磁力搅拌2h，因其分别带正电和负电，所以通过静电吸附作用可以得到含有不同ti3c2t
x
质量分数的5mg/ml iro
x
的稳定复合溶液，材料的形貌图如图2e,2f所示，扫描透射电镜图和能量散x射线光谱图如图2g,2h所示。
83.为了进一步证明iro
x
/ti3c2t
x
复合材料的成功制备，对其进行材料表面形貌分析，如图3所示(其中，a为iro
x
、ti3c2t
x
和iro
x
/ti3c2t
x
复合材料的x射线衍射图，b为拉曼光谱，c为傅里叶变换红外光谱图)，分别对其进行了x射线衍射分析，拉曼光谱分析和傅里叶变换红外光谱分析，均可得到材料的特征信号；以上的这些结果均可证明成功合成了iro
x
/ti3c2t
x
复合材料。
84.实验条件的优化
85.为了获得最佳的电化学性能，通过微分脉冲伏安法(dpv)对实验条件进行了优化，如材料比例、ph值、ab固定的浓度和抗原孵育时间(见图4，其中，a，b分别为mmp-8免疫传感器51的cv和eis图；c，d分别为il-1β免疫传感器52的cv和eis图(a为spe,b为cs/iro
x
/ti3c2t
x
/spe,c为ab/cs/iro
x
/ti3c2t
x
/spe,d为bsa/ab/cs/iro
x
/ti3c2t
x
/spe,e为ag/bsa/ab/cs/iro
x
/ti3c2t
x
/spe；)；e为iro
x
/ti3c2t
x
复合材料中四种不同质量分数ti3c2t
x
的dpv峰值；f为mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52的缓冲盐溶液ph值、g为mmp-8，h为il-1β的ab浓度，i为孵育时间的优化(除图e外，所有试验均与150ng/ml的mmp-8抗原或100ng/ml的il-1β抗原溶液孵育，所有试验均在3.0mm[fe(cn)6]
3-/4-和0.1m kcl缓冲溶液中进行))。
[0086]
(1)ti3c2t
x
质量分数的优化：因为电化学性能受复合材料中两种物质比例不同的影响，所以对复合材料中ti3c2t
x
的质量分数进行优化即1％、2％、5％和10％；如图4e所示，电流的峰值在质量分数为2％时达到最高值，所以含有2％ti3c2t
x
的5mg/ml iro
x
/ti3c2t
x
复合材料被选为修饰电极的最终材料。
[0087]
(2)缓冲盐溶液ph值的优化：由于ph值可以影响固定在免疫传感器上的抗原和abs的活性；因此，分别将与150ng/ml mmp-8和100ng/ml il-1β抗原溶液在37℃下培养后的免疫传感器放置在ph值为5.0-9.0的缓冲溶液中进行测试；从图4f可以看出，电流强度在ph为7.4达到最大；在il-1β免疫传感器52中也可以发现类似的变化趋势；因此，在随后的测量中
缓冲电解液选择了7.4的ph值。
[0088]
(3)抗体浓度的优化：共价连接在cs/iro
x
/ti3c2t
x
/spe上的ab的数量决定了它与目标分析物的结合效率；因此，五种不同浓度的mmp-8和il-1β的抗体(0.78-12.50μg/ml)分别与150ng/ml mmp-8和100ng/ml il-1β抗原溶液在37℃孵育来优化传感性能；如图4g和4h所示，mmp-8和il-1β的抗原/ab/cs/iro
x
/ti3c2t
x
/spes分别与3.12和6.25μg/ml的ab浓度孵育时拥有最小的电流强度，表明此时抗原和ab之间的特异性结合最大。
[0089]
(4)抗原孵育时间的优化：采用上述优化后的最佳条件分别将mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52与150ng/ml mmp-8和100ng/ml il-1β抗原溶液孵育10-50min；如图4i所示，电流峰值从10min到40min逐渐下降，然后达到一个平稳状态，说明孵育时间在40min时抗原抗体即已达到最大的结合效率；因此，所有的后续测试都是在ph为7.4，mmp-8和il-1βab浓度分别为3.12μg/ml和6.25μg/ml，抗原孵化时间为40min的条件下进行。
[0090]
如图1所示，作为本发明一个优选的实施例，所述微流控芯片包括：
[0091]
芯片件，所述芯片件包括：
[0092]
芯片基层6，开设有两个电极固定槽7；
[0093]
芯片顶层3，开设有检测池9和液体微通道4，所述检测池9通过液体微通道4与进样件相连，用于接收进样件提供的样品并使样品与平面型免疫传感件发生反应；
[0094]
芯片固定螺钉2，用于将芯片顶层3和芯片基层6与平面型免疫传感件连接固定；
[0095]
进样件1，与所述芯片件相连，用于提供检测样品，所述进样件1包括：
[0096]
样品进样管11；
[0097]
pbs缓冲液进样管12；
[0098]
氧化还原对进样管13；
[0099]
出样管10，一端与所述检测池9相连，用于将检测池9内的样品送出。
[0100]
在本实施例的一种情况中，工作电极8是平面型免疫传感件的一部分，芯片件由芯片基层6、芯片顶层3和芯片固定螺钉2构成；组装时，先将平面型免疫传感件5安装在芯片基层6的电极固定槽7中，再依次将芯片顶层3、芯片固定螺钉2、进样件1和出样管10组装上；使用时，样品由样品进样管11泵入，通过液体微通道4流入样品检测池9中，与其中装配的平面型免疫传感件反应，使电流信号发生变化，从而根据电流信号得出患者牙周健康状况结果。
[0101]
本实施例提供了一种牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0102]
制备mmp-8免疫传感器51；
[0103]
制备il-1β免疫传感器52；
[0104]
制备微流控芯片；
[0105]
将mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52组装在微流控芯片上即得。
[0106]
在本实施例的一种情况中，微流控芯片是用3ds max 2020软件(autodesk,u.s.a.)精心设计，并用hp multi jet fusion 3d打印机(hewlett-packard,inc.,palo alto,ca)通过立体光刻(sla)技术制作的；微流控芯片由三个输入口(分别用于样品、缓冲液和氧化还原对流入)，两个检测室(直径：7mm；深度：0.8mm)，一个用于废液流出的出口以及一些微通道(宽度：1mm；深度：0.5mm)组成；将制备好的平面型mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52与制备好的微流控芯片组装在一起，具体如图5所示；当检测液体通过液体
微通道4被引入后，它们将被转移到不同的检测池9中并与检测池9中装配的平面型mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52反应，使电流信号发生变化；电化学性能通过循环伏安法(cv)、电化学阻抗法(eis)和差分脉冲伏安法(dpv)进行表征和测试。
[0107]
实验例
[0108]
对mmp-8和il-1β的检测(见图6，其中，a、b分别为mmp-8免疫传感器51的dpv图和i-c图；c、d分别为il-1β免疫传感器52的dpv图和i-c图；e、f、g分别为制备的平面型免疫传感器的重复性，长期稳定性，抗干扰性和选择性图；h为微流控装置检测临床样本结果图)
[0109]
(1)配置标准溶液：配置不同浓度的mmp-8和il-1β抗原的标准溶液(包含无浓度的一组空白溶液)。
[0110]
(2)修饰工作电极8：将(1)中制备mmp-8和il-1β标准溶液分别滴涂在制备的mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52工作电极8表面，在37℃条件下孵育40min进行抗原-抗体的特异性结合，随后用生物缓冲液对其进行冲洗，以去除未结合的抗原，得到待测的修饰电极。
[0111]
(3)绘制工作曲线：将(2)中制备好的电极置于含有3mm铁/亚铁(k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6])(1:1)和0.1m氯化钾的、ph＝7.4的磷酸盐(pbs)溶液中进行测试，分别检测不同浓度mmp-8和il-1β抗原标准溶液的dpv曲线如图6a,6c所示，并检测mmp-8和il-1β抗原标准溶液浓度c与电流i之间的线性关系，绘制i-c曲线，本发明测试结果如图6b,6d所示。
[0112]
(4)性能的探究：将制备的mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52与含有50ng/ml的mmp-8和100ng/ml的il-1β溶液孵育，在上述相同条件下检查五个不同的免疫传感器来评估重复性。如图6e所示，mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52的rsds分别为1.1％和1.3％。随后，通过连续测试制备的免疫传感器在4周内的电流反应来研究免疫传感器的长期稳定性。如图6h所示，mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52对50ng/ml mmp-8和100ng/ml il-1β分别保留了原响应值的96.1％和94.9％，显示出良好的长期稳定性。此外，在实际应用中分析物之间以及分析物和其他类似物质间无交叉干扰是一个重要的必备因素，因此还探究了mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52与相似物质的交叉干扰和选择性。如图6g第1-4列所示，所制备的mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52的电流仅在含有相关目标生物标志物(150ng/ml mmp-8和100ng/ml il-1β抗原溶液)的pbs中明显下降，表明成功制造了可以同时检测mmp-8和il-1β的无交叉干扰的免疫传感器。此外，通过在含有mmp-8和il-1β抗原的pbs中引入10倍浓度的其他潜在干扰物质，如唾液中的癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)、葡萄糖(glu)和抗坏血酸(aa)，进一步研究mmp-8免疫传感器51和il-1β免疫传感器52的选择特异性。从图6g的其他列可以发现，即使面对高浓度的干扰物，电化学反应的变化也很轻微，表明该免疫传感器具有良好的选择性。所制备的免疫传感器之间以及与唾液中其他高浓度干扰物的交叉反应可以忽略不计，这使所制备的免疫传感器具有准确检测唾液中mmp-8和il-1β的能力，从而诊断牙周炎。
[0113]
(5)实际环境中的检测：分别将不同浓度的mmp-8和il-1β抗原标准溶液加入到制备好的人工唾液中，未加入标准溶液的人工唾液为空白样品。然后用蠕动泵将20μl上述添加了mmp-8和il-1β抗原的人工唾液由样品通道输送到微流控装置的检测池9中，将装置置于37℃孵育40min后，用蠕动泵将生物缓冲液泵入检测池9中，清洗后再将含有氧化还原对
k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]的电解液泵入检测池9，对其进行步骤(3)的测试。
[0114]
(6)临床唾液样本检测：所有的临床唾液样本都是从吉林大学口腔医院获得。共收集30名受试者的口腔全唾液，包括10名健康人、10名牙龈炎患者和10名牙周炎患者。要求所有受试者在采样前1小时内不要进食、饮水、刷牙或漱口，并在上午9:00至11:00之间进行唾液采集。受试者吐出未受刺激的全唾液到塑料管中，并在-80℃下冷冻。在检测前，冷冻的唾液样本被解冻并离心，以去除不溶性颗粒和唾液中高粘性粘蛋白可能带来的干扰，然后取上清液并加入0.01m pbs稀释并保存唾液中的抗原成分。此后，将20μl的上述样品泵入微流控装置进行检测。检测结果如图6h所示，10名健康人的mmp-8和il-1β反应电流最高，而牙龈炎和牙周炎患者对应的电流强度明显降低。正如预期那样，牙周炎组明显低于牙龈炎组，表明该传感器不仅可以在牙周炎的早期阶段进行诊断，还具有区分疾病严重程度的能力，从而为指导临床提供了宝贵的证据。此外，mmp-8或il-1β生物标志物的电流响应临界值在一些不同疾病状态的患者中比较接近，这可能是由于个体差异或其他系统因素造成的。而同时结合分析两种生物标志物的电流反应值，可以更准确地确认不同疾病状态。综上所述，这种具有良好免疫传感性能的微流控装置可以通过poct方式同时检测两种关键生物标志物，实现对牙周炎的早期诊断和监测，有望应用于牙周炎的临床诊断和指导临床，特别是对生活在医疗条件不足的弱势体。
[0115]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0116]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：

1.一种牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，包括：微流控芯片；平面型免疫传感件，安装在所述芯片件上，所述平面型免疫传感件包括：mmp-8免疫传感器；il-1β免疫传感器，用于配合mmp-8免疫传感器通过唾液对牙周炎进行早期诊断和监测。2.根据权利要求1所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述mmp-8免疫传感器通过如下方法制备而成：合成氧化铱碳化钛复合纳米材料；将丝网印刷电极用去离子水清洗并在室温下干燥；将合成氧化铱碳化钛复合纳米材料与壳聚糖超声混合均匀，然后取混合溶液滴加在丝网印刷电极上，并在红外灯下干燥；将红外干燥后的电极在室温下浸泡在戊二醛水溶液中，然后用去离子水冲洗；将冲洗后的电极浸入mmp-8抗体溶液中，孵育后用生物缓冲液冲洗电极表面；将用生物缓冲液冲洗后的电极与牛血清白蛋白溶液孵育，完成后用生物缓冲溶液冲洗，然后储存在生物缓冲液中备用。3.根据权利要求2所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述il-1β免疫传感器采用如下方法制备而成：合成氧化铱碳化钛复合纳米材料；将丝网印刷电极用去离子水清洗并在室温下干燥；将合成氧化铱碳化钛复合纳米材料与壳聚糖超声混合均匀，然后取混合溶液滴加在丝网印刷电极上，并在红外灯下干燥；将红外烘干的电极在室温下浸泡在戊二醛水溶液中，然后用去离子水冲洗；将冲洗后的电极浸入il-1β抗体溶液中，孵育后用生物缓冲液冲洗电极表面；将用生物缓冲液冲洗后的电极与牛血清白蛋白溶液孵育，完成后用生物缓冲溶液冲洗，然后储存在生物缓冲液中备用。4.根据权利要求3所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述合成氧化铱碳化钛复合纳米材料为：通过自上而下的选择性蚀刻合成碳化钛纳米片，用静电纺丝工艺合成氧化铱纳米管。5.根据权利要求3所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述壳聚糖的质量浓度为1％；所述戊二醛水溶液的质量浓度为1％，浸泡时间为30min。6.根据权利要求3所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述牛血清蛋白溶液的质量浓度为1％。7.根据权利要求1所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述微流控芯片包括：芯片件；进样件，与所述芯片件相连，用于提供检测样品；出样管，一端与所述检测池相连，用于将检测池内的样品送出。8.根据权利要求7所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述芯
片件包括：芯片基层，开设有两个电极固定槽；芯片顶层，开设有检测池和液体微通道，所述检测池通过液体微通道与进样件相连，用于接收进样件提供的样品并使样品与平面型免疫传感件发生反应；芯片固定螺钉，用于将芯片顶层和芯片基层与平面型免疫传感件连接固定。9.根据权利要求7所述的牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器，其特征在于，所述进样件包括：样品进样管；pbs缓冲液进样管；氧化还原对进样管。10.如权利要求1-9任一所述牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备mmp-8免疫传感器；制备il-1β免疫传感器；制备微流控芯片；将mmp-8免疫传感器和il-1β免疫传感器组装在微流控芯片上即得。

技术总结

本发明涉及一种牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器及其制备方法，属于医疗器械技术领域，牙周炎检测用微流控电化学免疫传感器包括：微流控芯片；平面型免疫传感件，安装在所述芯片件上，所述平面型免疫传感件包括：MMP-8免疫传感器；IL-1β免疫传感器，用于配合MMP-8免疫传感器通过唾液对牙周炎进行早期诊断和监测。本发明的传感器对牙周炎的早期诊断和监测具有重要意义，解决了传统检测方法中费用昂贵，需要专业人员，操作复杂，不利于椅旁操作等问题。问题。问题。