泰尹网wiy5Abstract
Snapin regulates the function of Cav1.3 calcium channel by whole patch-clamp recordings. The results are as follows:
1. Snapin colocalizes with Cav1.3 Ca2+ channel in the cell membrane
The colocalization of Cav1.3 and Snapin in the cell membrane was identified by immunofluorescence assays in either HEK293 cells overexpressed them and atrial myocytes isolated from mouse atrium.
2. Snapin interacts with Cav1.3 Ca2+ channel
The physical interaction between Cav1.3 Ca2+ channel and Snapin was confirmed by co-immunoprecipitation assays in HEK293 cells heterologously co-expressed them and in mouse atrial tissues.
3. Snapin affects the electrophysiological characteristics of Cav1.3 Ca2+ channel
毛刷制作We further analyzed the effects of Snapin on electrophysiological characteristics of Cav1.3 calcium channel in HEK293 cells heterologously co-expressed them by using whole cell patch clamp. Results s
how that Snapin significantly reduce the density of I Ca-L, accelerate the process of steady-state activation and delay the process of deinactivation.
All the results indicated that Snapin can interact with Cav1.3 calcium channel in the mammalian system and affect the electrophysiological characteristics of Cav1.3 Ca2+ channel: inhibition of Cav1.3 I Ca-L density, acceleration of steady-state activation process and delay of deinactivation process. This suggested that Snapin mediated the membrane excitation by inhibiting the Cav1.3 I Ca-L.
Key words: Cav1.3 calcium channel, Snapin, HEK293 cell, atrium
HOST 格式英文缩写词表
英文缩写词表
英文缩写英文全名中文译名
AP alkaline
phosphatase 碱性磷酸酶
A VN atrioventricualr 房室结
BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白
DHP dihydropyridine 二氢吡啶
sulfoxide 二甲基亚砜
DMSO dimethy
serum 胎牛血清
FBS fetal
bovine
GFP green fluorescent protein 绿荧光蛋白
HEK 293 human embryonic kidney 人胚肾上皮细胞 G 免疫球蛋白
IgG immunoglobulin
LVDCC L type voltage-dependent caicium channel 电压依赖的L型钙通道 gel
electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE polyacrylamide
PBS phosphate buffer salt 磷酸盐缓冲液
PFA paraformadehyde 多聚甲醛
fluoride 苯
PMSF phenylmethylsufonyl
dodecylsulfate 十二烷基硫酸钠
SDS sodium
本人郑重声明：
1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。
2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。
触控开关3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。
4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。
5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。
研究生签名：
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前言
钙信号是生物细胞信号转导途径中最重要的第二信使之一，参与生物体的许多生理功能，如生物膜通透性及细胞兴奋性的控制、细胞代谢、细胞形态的维持、细胞周期调控及基因表达等。心肌细胞是机体内利用钙离子方式最多的一种细胞，钙离子对心肌细胞的最基本功能即参与兴奋收缩耦联，触发心肌收缩的钙离子来自两条途径：（1）胞外钙经过细胞膜上电压依赖的钙离子通道流入胞内，（2）进入胞内的钙离子结合并激活肌质网（sarcoplasmic reticulum，SR）钙释放通道雷诺丁受体（Ryanodine receptor，RyR），引起其开放，继而使肌质网贮存的钙离子释放到胞浆内（即所谓的钙引起的钙释放，calcium-induced calcium release，CICR）。细胞内钙离子浓度升高后，一方面与肌钙蛋白结合，触发心肌收缩；另一方面与钙调蛋白（Camodulin，CaM）结合，激活多种蛋白激酶（如腺苷环化酶、磷酸二脂酶、Ca2+ /钙调蛋白激酶II等）蛋白水解酶、核酸酶等，从而调节细胞代谢、细胞周期等。随着每一次心跳进入胞内的钙离子必须被排除到胞外，以维持心肌细胞内钙离子稳态和确保心肌的舒张。心肌细胞内的 Ca2+可通过心肌细胞膜上钠钙交换器（Na+ /Ca2+ exchanger） 钢套箱>压脉带
和 ATP 酶依赖的钙离子泵（Ca2+ - ATPase）排除到细胞外或通过 SR 的 Ca2+ - ATP 酶（SERCA）将 Ca2+重摄取回来降低细胞内 Ca2+浓度。
心肌细胞含有几种类型的 Ca2+通道：表达于细胞膜表面的 L 型钙通道，T 型钙通道以及位于细胞亚膜受体的通道：肌质网上雷诺丁受体 RyRs 的 Ca2+释放通道和 1,4,5 - 三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3）受体 Ca2+释放通道。T 型钙通道存在于胚胎期的心室肌细胞、成年期心房肌细胞、浦肯野纤维细胞、窦房结及潜在起搏细胞中。而 L 型钙通道则大量的存在于心肌细胞中，就功能而言，L 型钙通道电流（I Ca-L）不仅参与心肌动作电位平台期的形成和维持，在心肌兴奋－收缩耦联中起着极为重要的作用，而且，由心肌细胞膜上 L 型 Ca2+通道激活而引发的Ca2+内流是触发肌质网贮存 Ca2+ 释放、调控细胞内信号转导和基因表达的重要始动因素。
L 型钙通道至少由 4 个亚单位组成，包括α1，β，α2/δ，在某些组织中还有γ亚基。α1 亚单位由 4 个同源性跨膜结构域组成（Ⅰ-Ⅳ），以近似对称的方式排列，每
个结构域包括 6 个跨膜片段（S1-S6）；α1 亚单位包含有感受膜电位变化的电压感受器、决定通透离子种类的选择性滤器和各种已知的被第二信使、药物和毒素作用的结合位点等，是 Ca2+通道的主要功能亚基[1]。因此，Ca2+通道药理学、电生理学的差异主要取决于 α1 亚基的种类。
目前已知，在哺乳类组织，编码 L 型Ca2+ 通道 α1 亚基的基因有 4种，根据组织来源分别称作 α1S、
α1C、α1D 和α1F；对应于基因命名法，分别称作Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3 和 Cav1.4。Cav1.1（α1S）的表达仅限于骨骼肌[2]，Cav1.4（α1F）则只局限表达于视网膜[3]。Cav1.2（α1C）以心血管系统的分布占优势[4]，而 Cav1.3（α1D）则被认为主要表达于神经元和神经内分泌细胞[5-7]。长期以来，人们一直认为在心脏生理和病理生理活动中起作用的 L 型钙通道以及Ca2+ 通道阻断剂对心脏疾病的作用的实现对象均是 Cav1.2 钙离子通道蛋白。然而，近年来这种观点受到一系列实验证据的挑战。Takimoto[8]、Mangoni等[9]分别在大鼠、小鼠和人的心肌组织中证实了 Cav1.3 通道RNA的存在，但集中表达于心房肌而非心室肌[10]。与 Cav1.2 相比，Cav1.3 通道被激活的膜电位更偏向于超极化方向（约有 10mV 的偏移）。这种特性允许 Cav1.3 钙离子通道参与心肌起搏组织的舒张期去极化[10,11]。而 Namkung 等、Stefan 等以及 Zhang 等报道，在编码 Cav1.3 钙通道的基因敲除小鼠中，其显著的表型不仅有听力缺失，而且有明显的窦性心动过缓和房室传导阻滞[9-11]，心肌 L 型Ca2+ 电流的密度较野生型小鼠减少 79%。这提示，Cav1.3 钙离子通道在构成窦房结 L 型Ca2+ 电流中占有重要地位，对通常认为 L 型 Ca2+ 通道仅在窦房结舒张期去极化仅起很小作用的观点提出质疑。基于以上的研究，表明Cav1.3钙离子通道在维持正常心脏节律中也发挥至关重要的重要作用。
在心脏中，有许多不同的信号通路可对心肌 L 型钙离子通道进行调节，以确保L 型 Ca2+电流I Ca-L 被精确的调节而发挥其正常的功能。心肌 L 型钙离子通道除了可被膜电位去极化激活外，还可被多种神经递质、激素和细胞因子等调节。其信号转导途径有多种，例如：cAMP 依赖的蛋白激酶A（PKA）
激活 L 型Ca2+通道的信号转导途径、蛋白激酶C（PKC）激活途径、cGMP 依赖的蛋白激酶G（PKG）调节途径。因为前期人们一直认为心脏中的 L 型钙离子通道为 Cav1.2，所以更多的关注于 Cav1.2 钙离子通道活性的调节。研究表明， PKA 通过锚定蛋白 APAK15定位至 Cav1.2 钙离子通道附近，通过α1C 亚单位的 C -末端保守序列 mLZ（modified
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