山东农业大学学报(自然科学版),2008,39(4):653-656Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science )
黄春晓，段学军
(中原工学院能源与环境学院，河南郑州 451191)
摘要：定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。创建突变库的方法已经有很多而且比较通用，而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法，介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用，分析了存在的问题及发展趋势。 关键词：定向进化；高通量筛选方法；展示技术；流式细胞分选技术
中图分类号:Q 93 文献标识码:A 文章编号:1000-2324(2008)04-0653-04
收稿日期:2006-07-27
基金项目：河南省教育厅自然科学基金
作者简介：黃春晓(1968-)，女，汉族，河南叶县人，副教授，硕士，主要从事环境生物技术的研究。
HI GH -THR OUGHPUT SCREENI NG M ETH ODS I N THE D I RECTE D EV OLUTI O N OF PR OTEI NS
HUANG Chun -xiao,DUAN Xue -jun
(College of Energy &Envir onment of Zhongyuan University of Technol ogy ,Zhengzhou 450007,China )
Abstract:D irected evoluti on is a ne w po werful strategy f or engineering p r oteins .Many feasible methods f or gen 2erating gene libraries are devel oped .Therefore devel op ing the high -thr oughput screening methods f or desired mutants is the key t o the success in directed evoluti on .I n this article,we summarize the high -thr oughput screening methods devel oped resent years such as F ACS (Fluorescence -activated cell s orting )and the dis p lay technol ogy including phage dis p lay,cell -surface dis p lay,ribos o me dis p lay and mRNA -pep tide fusi on .Their p rinci p les and app licati on in screening for desired mutants fr om mutant libraries are intr oduced .W e
discuss the unres olved questi ons and p r om ising p r os pect in the screening methods .
Key words:D irected evoluti on;high -thr oughput screening;method;dis p lay technol ogy;F ACS 定向进化技术可以将自然界漫长的蛋白质改造过程缩短到数年、数月、甚至数天。蛋白质体外定向进化技术已成功地应用于酶活力的提高、药物蛋白特性的改进、新代谢途径的获取等众多领域，对工农业生产、医药卫生、环境工程等行业有重要的意义。蛋白质定向进化的关键步骤包括(1)建立目的蛋白质基因的突变体文库;(2)通过合适的筛选系统，快速地从突变体文库中筛选出符合目标的蛋白质。随着定向进
化的不断发展和广泛应用，创建基因突变库的方法已有很多[1][2]，已不再是阻碍定向进化速度的关键。目
前定向进化的最大瓶颈是缺乏高通量的筛选方法，很多研究者致力于寻灵敏度高、快速、简便的筛选方法。
1传统筛选方法及其局限性
当突变体酶可赋予宿主细胞生长或存活的优势时，很容易搜寻含有106以上个蛋白质突变体的文库。
然而，这类情况并不多见[3]。
目前，对于酶活的筛选传统方法大多是利用琼脂平板克隆筛选或检测粗酶裂解液的酶活。琼脂平板克
青嵩素隆筛选主要是针对表达蛋白特殊化学性质的筛选方法，包括利用固体平板上底物产生的颜变化或菌落周围产生的水解圈进行筛选等。如用含有淀粉和锥虫蓝的LBSP 的固体平板可以对产淀粉酶的克隆进
行筛选，菌落周围淀粉水解圈的大小与淀粉酶活性呈正相关[4]。琼脂平板克隆筛选简单易行，但是非定
量的，而且经常对性状的微小变化不灵敏，一般用于初步筛选。对粗酶裂解液进行酶活检测是一种普遍使用的方法，但是筛选效率相对较低，如果不使用自动化的仪器辅助，很难达到高通量筛选的目的。
传统的筛选方法在很大程度上限制了突变库容及筛选能达到的通量。近几年新发展起来的各种展示技术和流式细胞分选技术克服了传统方法的缺点，特别适用于高通量筛选，在蛋白质定向进化中有广阔的应用前景。
2
蛋白质定向进化的高通量筛选方法2.1各种展示技术
2.1.1噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术，编码外源多肽
的DNA 以融合形式与噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌体表面，经过“吸附—洗脱—扩增”这是一种表型与基因型的统一。噬菌体展示技术最初是以M13噬菌体为载体，噬菌体和T4噬菌体等展示系统。这些展示系统各有各的优势，但最常用的仍是P Ⅷ蛋白以维持噬菌体衣壳蛋白的完整性[5噬菌体展示系统在对酶活进行筛选时主要的问题在于如何将酶与催化所得的产物联系起来。有一种策略是将底物连接到表达目的酶的噬菌体上，有活性的突变体转化底物成为产物，而产物依然连接在噬菌
体表面，再通过能够特异吸附产物的层析柱，带有活性酶的噬菌体被分离出来[6]。
噬菌体展示技术实现了物质的基因型和表现型之间的转化，使人们容易对其进行一系列的生化和遗
传操作，与传统方法相比它具备库容量大、表达无偏差、筛选简便等优点[7]。
2.1.2微生物细胞表面展示技术 微生物细胞表面展示技术的原理是：通过靶蛋白(外源蛋白)基因序列与载体蛋白基因序列(定位序列)融合后导入宿主细胞，从而使靶蛋白表达并定位于细胞表面。革兰氏阴性菌展示系统的主要宿主细胞是大肠杆菌，要在细胞表面实现外源蛋白的功能展示，必须具有分泌和定位到细胞表面的机制，且不干扰细胞的正常功能，所以载体蛋白大部分是外膜蛋白。另外，鞭毛和菌毛的亚蛋白也可作为蛋白载体。革兰氏阳性菌的主要宿主是葡萄球菌，在葡萄球菌表达系统中，借助葡萄球菌蛋白A (SpA )的信号肽和细胞表面结合区，可将外源肽输送到细胞表面。
大肠杆菌因缺乏在内质网内对蛋白质有效折叠所需的折叠酶和分子伴侣，表达含有二硫键的哺乳动物蛋白
的能力很有限[8]。而酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优
越性，所以酵母表面展示系统是常用的真核展示系统。目前已报道的酵母表面展示系统有两种，目的蛋白分别与α或a 凝集素融合，展示于酵母细胞表面。酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力、稳定性及酶活性的定向进
化已有成功报道。Shiraga [9]等利用酵母展示系统构建了一种脂肪酶表达活性中心的基因突变库，在脂肪酶基
因和α-凝集素C 端插入一段丝氨酸/甘氨酸的重复序列，使融合蛋白中的脂肪酶活性中心能够更好地与底物作用，增强了脂肪酶的水解活性，获得了底物特异性改变的突变体。
虽然，近年来细胞表面展示表达体系发展很快，但也存在一些问题如表达体系仅能表达单链多肽，对多个亚单位的蛋白不适合，融合目的蛋白常伴随着细胞表面变化等。
2.1.3核糖体展示 噬菌体展示系统和细胞表面展示系统等都需要生物活细胞的参与，由于受转化效率
的限制，每次转化都会造成突变库多样性的损失。而且在表达某些候选蛋白质分子时，宿主菌的生长被抑制或者由于其毒性作用而不能生长，导致亲和筛选的偏差，一些候选分子会有丢失。核糖体展示技术完全在体外进行，弥补了细胞表面展示的不足。因此，能显著增加库容量及分子多样性，其中库容量可达1013～1015，比噬菌体展示文库(约109)提高了104～106倍[10]，而且可以应用于任何有细胞毒性分子的筛选与研究，显示出了诱人的发展前景。
无线存储1997年,Pluckthun 实验室在早期多肽多聚核糖体展示技术的基础上建立了体外筛选完整功能蛋白的
新技术—核糖体展示技术(ribos ome dis p lay )[11]。其基本原理是：编码蛋白的DNA 在体外进行转录与翻
译，由于对DNA 进行了特殊的加工与修饰，去掉了3′末端终止密码子，翻译过程中核糖体会停留在mRNA
・456・山东农业大学学报(自然科学版) 第39卷
的3′末端，从而形成以非共价键连接的“mRNA -核糖体-蛋白质”三元复合体，然后即可进行体外目标蛋白筛选，最后利用mRNA 的可复制性，使靶基因(蛋白)得到有效富集。
Jer mutus [12]等利用核糖体展示技术筛选到1.1n mol 高亲和力的ScFv 单链抗体。
由于受核糖体展示体表面与大小的影响，在核糖体大分子和被展示的小分子之间可能会发生一些不
可预测的变化，而导致一些高亲和力的目标分子丢失[13]。
变速箱取力器
2.1.4 mRNA -多肽融合技术 为克服早期建立的核糖体展示技术的缺陷,Roberts [14]等设计了mRNA -
多肽融合技术，该技术与核糖体展示技术相似，也是在体外进行。在mRNA 的3′末端连入一个嘌呤霉素标记的DNA linker 片段，嘌呤霉素是一种模拟t RNA 末端氨酰基的抗生素，它通过进入核糖体A 位点，接纳由核糖体的肽酰转移酶作用产生的新生肽，从而抑制蛋白质的翻译，形成含有稳定的酰胺键的肽酰嘌呤霉素复合物。所以，体外翻译时核糖体会停在DNA linker 与mRNA 之间的连接处。多肽-嘌呤霉素-mRNA 复合物与核糖体解离后，直接用于筛选。该技术利用嘌呤霉素将mRNA 与多肽以共价键的形式联系起来，从而避免了核糖体展示中因缺少稳定的共价键使得核糖体三元复合物不够稳定的问题，更适合于严谨条件下靶标分子的筛选。
核糖体展示和mRNA -多肽融合技术是筛选大型文库和获取分子进化强有力的方法，但仍然存在一些机制问题有待解决。核糖体展示和mRNA -多肽融合技术筛选的成功要求核糖体能将蛋白质翻译完全以使其能够正确折叠。然而在体外翻译时，虽然大部分新生肽链在离开核糖体之前已经翻译完全并正确折叠，但还有少部分不是这样，那么后者就会引入不正确的折叠产物，限制靶标分子的富集，增加筛选
的非
特异性[10]。
2.2流式细胞分选技术
2.2.1流式细胞分选技术的原理 流式细胞术(Fl ow cyt ometer,FC M )又称为荧光激活细胞分选技术(Fluorescence -activated cell s orting ,F ACS )，是一项对细胞或其他微小生物颗粒快速定量分析的技术。它能同时对样品的多种物理和生物学参数进行定量检测，并可以实现对特定细胞体进行快速的分选。流式细胞仪主要由4部分组成—细胞流动室，激光聚焦区，检测系统，数据处理系统。流式细胞术核心技术主要包括样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。流式细胞术早期主要应用于医学领域中的肿瘤学、免疫学和血液学的研究，最近几年，已经拓展到微生物学和分子生物学等研究领域。其原理是：将荧光染后的样品制备成细胞悬液，由气压装置送入流动室，流动室由样品管和鞘液管组成，鞘液管充满流动的鞘液，鞘液流与样品流压力不等，当两者压力差达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列细胞柱，细胞逐个通过喷嘴进入激光聚焦区。荧光素经激光照射激发特异性荧光，随后液柱破裂成千万个小液滴。仪器可根据是否携带特异性荧光选择其荷电或不荷电，再经过一高压静电场将其分选出来。经过几轮筛选后与荧光配基特异性结合的克隆得到极大富集。
2.2.2 流式细胞分选技术在胞质中表达的文库筛选中的应用 F ACS 仪器分析效率高，通过荧光信号可灵敏地检测和筛选多种酶活性。
精心设计荧光标记的底物，使得将胞质中表达的文库与标记的底物分子进行孵育，当标记的底物与文库结合时，标记的底物就被阻滞在胞内，相应的细胞就带上荧光标记，而未结合的荧光底物可自由通过细胞膜，通过多次洗涤过程可被去除。然后用F ACS 进行筛选和定量分析，经过几轮筛选后与标记底物特异
性结合的克隆就得到极大富集[15]。Am ir Ahar oni [16]等用此方法对唾液酰基转移酶CstII 突变体文库(>
106)进行筛选，把表达突变体基因的J M107NanA -细胞和唾液酸Neu5Ac 、荧光性胆固醇酯标记的乳糖一起孵育，经过洗涤之后用F ACS 进行分析和筛选，最终筛选到含一个F91Y 突变的突变体，酶的转移催化效率提高400倍。利用F ACS 可以对选择的阈值和富集进行精细的调节并且可以施加阳性选择的压力。
2.2.3流式细胞分选技术在微生物细胞表面展示文库筛选中的应用 正因为F ACS 强大的分选功能，展示在微生物细胞表面的蛋白质，可以通过加入荧光性配基或底物，采用流式细胞仪进行高通量筛选。最近几年来,F ACS 在微生物细胞表面展示文库的筛选应用中逐渐得到改进和完善。较为巧妙的是FRE
T -F ACS 方法，把F ACS 和荧光共振能量转换(FRET,fl ourescence res onance energy transfer )相结合。该方法利用特殊合成的底物从OmpT 酶变异体库中筛选高活性变异体。研究者设计合成了OmpT 酶的荧光共振能
・556・第4期 黄春晓等：蛋白质定向进化的高通量筛选方法
量转移底物，包括4个部分：荧光基团、带有三个正电荷的多阳离子尾巴、含有OmpT 酶特异性作用位点的链以及淬灭基团。由于细菌的表面带负电,FRET 底物可通过所带三个正电荷结合到细菌表面。细菌表面的OmpT 酶剪切淬灭基团，从而使荧光基团产生相应的荧光，然后通过F ACS 进行检测。通过此方法从
1.9×106变异体库中最终筛选出酶活提高60倍的OmpT 酶[17]。这一方法为利用F ACS 进行酶变异体的高通量筛选提供了新的思路。
流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有以下几个明显的优点：能够定量分析酶活性，同时测定多个参数，并且对每个观察到的克隆进行记录。
3展望
随着分子生物技术的发展，蛋白质定向进化高通量筛选方法的研究和应用有了巨大的进步，已从模型
筛选的研究中步入到各种实用的分子进化突变体的筛选，不仅成功地应用于多种酶的改造还成功地应用于DNA 的进化、酶分子以外的蛋白质进化如提高抗体的表达水平、改变抗体的亲和性等。但是，目前并没有一种通用的筛选方法适用于所有的改组蛋白，所以需要设计针对目的改造特征的筛选方法。要想将基因与酶的产物之间建立起直接的联系依然需要针对不同酶、不同反应和不同底物进行设计。通过酶活性进行筛选比利用酶与靶物质之间的亲和力来进行筛选困难得多。因此，建立一种能与酶活性相关联的亲和筛选方法非常重要。可选用抑制剂、底物、产物或酶促反应中间过度态类似物作为靶物质。荧光底物和F ACS 分选技术的应用是非常有潜力的一条途径,F ACS 和展示技术的相互结合有望在定向进化的高通量筛选方面做出更大的贡献。对那些无明显可借鉴表型的突变体筛选，可能是该领域工作者今后的工作侧重点。
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