2021.02·
Experimental research | 试验研究
体培养基（含卡那霉素），37 ℃条件下震荡培养至OD600≈0.6；利用IPTG诱导剂（终浓度0.5 mM），37 ℃环境下震荡培养3 h；在2 000 mL LB液体培养基中，菌液在37 ℃条件下，扩大培养至OD600≈0.6，降温至30 ℃；IPTG诱导（终浓度为0.5 mM），30 ℃环境中震荡培养；离心收集菌体，将菌体重悬于NTA-0缓冲液，再超声破碎菌体；离心，收集上清及沉淀进行SDS-PAGE检测[3]。树脂制品
由于该重组蛋白在诱导表达过程中形成包涵体，因此需通过对包涵体的变性与复性处理，以纯化重组蛋白。上述过程中收集的沉淀，重悬于50 mL STET缓冲液中，加入DTT至终浓度1 mM，超声，离心并去上清；沉淀以PBS重悬，超声，离心并去上清；以4 mL SKL重悬包涵体，加DTT至终浓度5 mM，震荡溶解包涵体，离心取上清；4 ℃环境下，将2倍体积的3 M盐酸胍稀释蛋白溶液，加入到200 mL复性液（pH=8.0）中，搅拌均匀；将该蛋白溶液置于透析袋中，以PEG20000浓缩体积至50～100 mL，4 ℃TE缓冲液透析过夜；浓缩体积为2～4 mL时，4 ℃TE缓冲液透析过夜[4]。 上清蛋白溶液过N i-N T A柱；以N T A-0缓冲液（pH=8.0）洗柱；分别以含20、60、200和500 mM咪唑
的洗脱液洗脱，分段收集洗脱液；对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。将纯度达到要求的组分于4 ℃以TE透析，换液2次；4 ℃超滤浓缩透析产物，进行SDS-PAGE电泳检测[5]。
过氧化氢浓度测定
2 结果
2.1 重组表达载体构建与鉴定
将目的基因与原核表达载体pET-SUMO连接，以构建重组表达载体，用Not Ⅰ和Cpo Ⅰ，对重组表达载体pET-SUMO-fUMOD进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，于1 047 bp处可见1条清晰条带，与预期片段大小相符，见图1。连接产物转化感受细胞后，挑取阳性克隆进行小量表达及鉴定，54 ku处出现明显条带，表明pET-SUMO-fUMOD构建成功且重组蛋白能表达，见图2。
图1 酶切产物检测 图2 阳性克隆小量表达结果 M：蛋白maker；1：未诱导；2：诱导后2.2 重组蛋白表达及验证
在重组质粒导入菌体后，利用15% SDS-PAGE分析经IPTG诱导后的菌体。结果表明，30 ℃，IPTG终浓度为0.5 mM条件下，在沉淀中发现54 ku明显条带，与预期相符，表明fUMOD在这一诱导条件下形成包涵体且表达较高，见图3。随后，进行包涵体蛋白纯化，结果显示，在54 ku处出现1条明显的反应条带，表明fUMOD 重组蛋白能成功表达，见图4。
图3 重组蛋白表达结果 图4 包涵体蛋白纯化后 SDS-PAGE检测结果
M：蛋白marker；1：沉淀；2：上清M：蛋白marker；1：Ni柱纯化后3 讨论与结论
慢性肾衰是猫的高发疾病之一，通常在确诊为慢性肾衰时，猫肾脏功能已损失75%以上，因此，早期发现慢性肾衰是关键环节。尿调节蛋白作为正常人尿液中含量最多的一种蛋白，现研究表明其生物学功能多样，如调节水盐代谢、免疫调节、防止肾结石产生和防止尿路感染等。但猫尿调节蛋白的功能是否与人类相似尚不清楚，因此，本研究通过原核表达系统，制备了重组fUMOD，为进一步研究其在猫慢性肾衰发生发展中的作用奠定基础。交警制服
打火机设备参考文献
[1] Vyletal P，Bleyer A．J，Kmoch S．Uromodulin Biology and锌合金压铸工艺
Pathophysiology–An Update[J]．Kidney and Blood Pressure Research，2010，33（6）：456-475．
[2] Ferlizza E，Campos A，Neagu A，et al．The effect of chronic
kidney disease on the urine proteome in the domestic cat （Felis catus）[J]．Veterinary journal，2015，204（1）：73–81．
[3] 张礼勇．基因工程原理及进展[J]．科技资讯，2007（18）：7．
[4] 纪剑飞，张成刚．包涵体重组蛋白的纯化及复性[J]．沈阳药
科大学学报，1998（4）：72-76．
[5] Bleyer Anthony J，Kmoch Stanislav．Tamm Horsfall
Glycoprotein and Uromodulin： It Is All about the Tubules![J]．Clinical journal of the American Society of Nephrology，2016，11（1）：6-8．防臭鞋
14 ·2021.02
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议