影响酿酒酵母电击转化率的条件

秦玉静　金建玲　鲍晓明　高东

摘要　以酿酒酵母为材料，用穿梭质粒pYES2进行电击转化的条件实验．实验表明电击中电压大小、细胞的生长状态、处理条件和电击后细胞的培养时间以及质粒浓度等对电击转化率均有影响．取对数生长期酵母细胞，用二硫苏糖醇(DTT)处理以疏松细胞壁，加0．7　μg/mL质粒DNA，5 kV电压电击，转化后细胞在完全培养基中培养 60 min后，涂布选择培养基，转化率可达4．8×105个转化子／μg质粒DNA，细胞的存活率为39．2％，比完整细胞转化的效率高，存活率偏低．
关键词　酿酒酵母；电击转化；转化率
中图分类号　Q933

TRANSFORMATION OF S．CEREVISIAE BY ELECTROPORATION

Qin Yujing，Jin Jianling，Bao Xiaoming，Gao Dong
(State Key Lab.of Microbiol.Technol.,Shandong Univ.,Jinan)

ABSTRACT　Electrotransformation was performed to transfer shuttle plasmid pYES2 visiae.Voltage、cell grown、incubation　time and plasmid concentration affect transformation efficiency.The best conditions are the cell harvested at the exponential growth phase、5　kV、0．7　μg plasmid DNA and 1 h incubation time,transformation efficiency is up to 4．8×105 transformants per μg plasmid DNA,which is higher than intact cell transformation.The cell viability is about 39．2％．
Key words　S.cerevisiae;electrotransformation;transformation efficiency

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是单细胞真核生物，它不仅具有生长快，便于培养和遗传操作的优点，而且具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物加工修饰及分泌的能力，因此，酿酒酵母作为基因工程的表达系统日益受到重视．外源基因进入酵母菌一般采用转化的方法，［1～5］建立酵母的高效转化系统对深入地研究酵母菌分子生物学具有重要意义．1978年首次报导了酵母菌原生质体转化法，［1，2］这种方法转化率较高，但原生质体的制备及其再生的步骤比较繁琐，不利于转化子的快速制备．随后建立了完整酵母转化法，［3］方法简捷，但转化率偏低．1985年，Karube等人［4］利用电穿孔法转化酵母原生质体及完整细胞获得成功后，电击转化法以其高转化率，操作方便等优点越来越受到重视．现在，电转化技术理论不断提高，已被广泛用于酵母细胞外源基因导入．［5］本文以酿酒酵母H158为材料，利用BIOJET MI电穿孔仪(德国B.Braun公司生产)，研究了电击转化的几个条件，以期建立一套高效、简便的酵母外源基因转化系统．

1　材料与方法

1．1　菌株与质粒
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158(his-trp螺纹套套-leu-ura-)；
质粒pYES2(ura+Apr2μ鼠尾粟 ori)是E.coli与S.cerevisiae的穿梭质粒．
1．2　培养基
LB培养基：1%蛋白胨，0．5％酵母膏，1%NaCl，pH 7．0；
YPD完全培养基：2%蛋白胨，1%酵母膏，2%葡萄糖；
选择培养基：在基本培养基［6］中，根据质粒基因标记加入20 μg/mL的His,Trp和30 μg/mL的Leu．
1．3　酵母的电击转化
酿酒酵母(S.cerevisiae)H158接种于YPD培养液中，30　℃振荡培养至对数生长后期(OD600=1．0～1．5），3 000 r/min，4 ℃，离心15 min，收集菌体，用预冷的无菌水洗涤菌体两次，再用电击缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH7．5，270　mmol/L蔗糖，1 mmol/L MgCl2）洗涤菌体．用电击缓冲液悬浮菌体后，取适量菌悬液，加入质粒DNA混匀并转移至电击槽中电击，电击后取适量菌液涂布选择培养基，30　℃培养3 d，观察转化子．酵母细胞的存活率通过美兰染进行测定，转化率为每μg质粒truecrypt破解DNA产生的转化子数．
1．4　酵母的完整细胞转化［7］

2　结果与讨论

2．1　不同电压对转化的影响
实验中电压是实现电击转化的重要参数．一般认为，［8］电穿孔作用是通过触发细胞膜的电通透性增大，形成电致孔洞，从而使DNA等多种生物大分子进出细胞．在电击过程中，电压偏低，细胞不宜极化产生微孔通道，质粒DNA不能进入细胞，无法完成转化；如果电压过高，会导致大部分细胞因孔洞形成较大，不易复原而死亡，降低了酵母细胞的存活率，也影响了转化率．由图1可知，转化率随着电压的增加而变化，当电压为5 kV时，转化率最大，达到3．82×105转化子／μg DNA，电压继续增加转化率反而下降．酵母细胞的存活率随电压的增加不断降低，电压5　kV时，细胞的存活率为46．7％，这是由于电压对酵母细胞穿孔造成的．

液压阀芯

图1　电压对电转化的作用
A．电击转化率　B．细胞存活率
Fig.1　Effect of voltage on transformation efficiency
A.Transformation efficiency 　B.Cell viability curve

2．2　酵母细胞生理状态对转化的影响
2．2．1　酵母细胞的生长
酵母细胞的不同生长状态对转化有不同的影响，结果见图2．图中显示，不同生长时期的酵母细胞对转化率影响较大，处于对数生长中期的酵母细胞生长旺盛，细胞壁结构较稳定期细胞的细胞壁结构疏松，［9］因此，处于对数生长中期的酵母细胞的转化效果明显高于稳定期的细胞，即取菌体生长24 h，OD600约为1．2时的细胞进行电转化，转化效果比较理想，转化率可达到最高，即3．57×105转化子／μg DNA．

图2　细胞生长对转化的影响
a.细胞生长曲线　b.电击转化率
Fig.2　Effect of cell growth on transformation efficiency
a.Cell growth curve　b.Transformation efficiency

2．2．2　酵母细胞的处理
二硫苏糖醇(DTT)作为一种还原剂，可以疏松蛋白质的-S-S-键，用其作用于酵母细胞，可使细胞壁产生疏松，有利于电压在酵母细胞壁上作用，形成微孔洞，促进外源质粒DNA进入细胞．测定不同DTT浓度对转化的影响，结果见图3．由图可知，酵母细胞的转化率与DTT的浓度有关，随着DTT浓度的升高，转化率增大，当DTT浓度为30 m mol/L时，转化率达到最高为4．1×105转化子／μg DNA;但是DTT的加入有一定的限制，当DTT浓度过大时，转化率反而下降，可能是DTT对细胞壁中的蛋白作用较大，影响了细胞壁本身的生长，使细胞壁结构变化过大而不易恢复，从而降低了转化的效果．

图3　DTT浓度对转化的影响
Fig.3　Effect of DTT on transformation efficiency

2．3　质粒浓度对转化的影响
取不同浓度的pYES2质粒进行电击转化实验，结果见图4．

三爪卡盘结构从图中可以看出，电击转化率与质粒DNA的加入量有关，在DNA浓度达到0．7　μ导丝男士g之前，转化率是随着质粒浓度的上升而上升，但当质粒DNA加入浓度超过0．7 μg后，转化率反而随着DNA浓度的上升而下降，由此可知，质粒DNA的加入量在电击转化中有一定的限制，原因可能是当质粒DNA浓度较低时，电击产生的细胞孔洞可以允许大部分的DNA分子进入细胞，但当DNA加入量增大超过阈值时，细胞能吸收的DNA分子达到饱和，反而降低了电击的转化率．

图4　质粒DNA浓度对电转化的影响
Fig.4　Effect of plasmid DNA on transformation efficiency

2．4　电击后细胞的培养
电击转化后，酵母细胞在YPD中培养不同时间对转化率的影响见表1．

表1　不同培养时间对转化的影响
Table 1　Effect of incubation on transformation efficiency

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