基于慢病毒载体的体外基因已在临床试验中取得良好的效果，有望治愈⼀些造⾎系统的单基因遗传病。通过提⾼靶细胞转导效率和减少转导中病毒载体量，基因有效性、安全性和成本都可以得到改善。不同包膜糖蛋⽩伪型慢病毒载体通过与细胞膜表⾯的不同受体结合，促进病毒黏附和⼊胞，增强不同靶细胞的病毒转导效率。此外病毒转导增强剂可以在病毒进⼊细胞过程或进⼊后发挥作⽤，在提⾼转导效率的同时使靶转导基因在体内长期稳定表达。通过对这两类⽅法的总结回顾，旨在为慢病毒载体的转导效率提供新的优化策略，使基因得到更⼴泛的应⽤。 基因是指将外源正常基因⽚段导⼊靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因，从⽽实现缓解或治愈疾病的⼀种⼿段。1990年美国开展⾸例基因临床试验，并有效恢复ADA-SCID患⼉细胞ADA合成,⾃此开创了基因的先河。⽬前，基因在单基因和多基因遗传病、癌症、感染性疾病等中不断尝试，成为极具吸引⼒与开创性的新疗法[1]。
基因成功的关键是将外源基因安全有效地导⼊靶细胞或组织，因此载体选择是关键。研究者最早使⽤γ逆转录病毒载体 (gamma-retroviral vectors,RVVs)作为载体进⾏基因，成功实现外源基因导⼊，但因载体整合引起的插⼊突变和⽩⾎病的发⽣使RVVs在基因中的地位受到挑战[2,3]。由HIV改造⽽来的慢病毒载体(lentiviral vectors,LVVs)转导外源基因稳定⾼效，成为基因中常⽤的载体。
⽬前⼤部分临床前和临床体外基因试验是基于LVVs转导⼈造⾎⼲细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)实现的[4,5,6]。基因的临床效果取决于HSCs的⾼⽔平转导，虽可通过⼆次转导或提⾼感染复数(multiplicity of infection,MOI)增加转导率，但延长体外培养时间可诱导⼲细胞进⼊细胞周期⽽影响其分化增殖能⼒[7,8]；提⾼感染复数会提⾼插⼊突变风险和增加⽣产成本[8]。因此，在不断改造LVVs以增加安全性的同时，提⾼病毒转导效率是亟待解决的难题。
蜜饯LH慢病毒转导过程的限制因素包括病毒黏附、⼊胞、细胞运输及固有免疫作⽤。通过引⼊异源病毒包膜构建新的伪型载体和/或在转导过程中添加病毒转导增强剂(transduction enhancers,TEs)，可有效克服LVVs转导的障碍，增加转导细胞⽐例，从⽽达到临床需要的转导⽔平。
1 病毒包膜
病毒载体与细胞受体相互作⽤触发病毒包膜与细胞膜融合，这种趋向性由病毒包膜糖蛋⽩决定[9]。野⽣型HIV糖蛋⽩
gp120仅对⼈CD4+T细胞和单核细胞有特异性的亲和⼒，且只能产⽣低滴度载体，将HIV糖蛋⽩更换为异源糖蛋⽩有利于载体与靶细胞结合，从⽽提⾼转导效率[9]。
1996年⾸次发现⽔疱性⼝炎病毒G糖蛋⽩(vesicular stomatitis virus G glycoprotein,VSV-G)能被有效
地整合到HIV中，可获得⾼滴度载体并提⾼体外转导效率[10]。VSV-G伪型LVVs通过识别细胞表⾯低密度脂蛋⽩受体(low-density lipoprotein receptor,LDL-R)黏附和⼊胞,LDL-R在细胞膜上的普遍存在使VSV-G赋予LVVs进⼊多种细胞的能⼒，包括⾮增殖细胞如HSCs[9]。⽬前VSV-G 伪型LVVs⼴泛应⽤于⼈和其他哺乳动物细胞的转导，并在临床试验中重建X-SCID患者的免疫功能[7]。由于⼈静息T细胞、B细胞和HSCs的LDL-R⽔平⾮常低,VSV-G 伪型LVVs在这些细胞中转导效率低下[11]。通过添加细胞因⼦刺激可上调T细胞和HSCs的LDL-R表达提⾼转导细胞⽐例，尤其是HSCs提⾼约90倍[11]。
研究表明HSCs过度暴露于细胞因⼦可能会影响其归巢能⼒，并促进细胞分化，同时⾼载体剂量与强细胞因⼦刺激相结合还可能增加插⼊突变的风险[12]。猫内源性逆转录病毒(RD114)包膜糖蛋⽩的引⼊有效解决了这⼀问题,RD114伪型LVVs 在低MOI下较VSV-G伪型LVVs更有效转导HSCs，并保持⼲细胞特性[13]。同属于β逆转录病毒的狒狒内源性逆转录病毒(baboon endogenous retrovirus,BaEV)和RD114有很⼤关联，它们均识别靶细胞中性氨基酸转运蛋⽩2(neutral amino acid transporter,ASCT)[14]。ASCT-2在⼈T细胞、B细胞和HSCs上均表达，因此RD114和BaEV伪型LVVs可⽤于增强以上细胞的转导。BaEV还能识别ASCT-1，使其更易结合靶细胞且作⽤更⼴泛[15]。2014年Girard-Gagneapin等[14]⾸次报道BaEV伪型LVVs转导轻微刺激的⼈HSCs⽐例⾼达90%，未刺激的HSCs⽐例可达30%。此外BaEV伪型LVVs转导刺激的B细胞⽐例可达80%，同样条件下VSV-G伪型LVVs转导⽐例仅不到5%[14]。最近有数据表明,BaEV伪型LVVs能⾼效率转导初始T细胞和NK细胞[16,17]。
⿇疹病毒包膜糖蛋⽩为H/F蛋⽩，能识别受体CD46和信号淋巴细胞活化分⼦(signaling lymphocytic activation molecule, SLAM)[18]。SLAM仅在T细胞和B细胞表⾯表达,⽽CD46在⼈有核细胞均表达。H/F伪型LVVs能将静息T细胞和B细胞的转导⽐例提⾼⾄50%，在未刺激的HSCs中转导⽔平可达70%[19]。Lévy 等[20]报道H/F伪型LVVs有可能100%转导预刺激的HSCs。BaEV和H/F伪型LVVs能有效转导造⾎细胞，但很难获得含有这些糖蛋⽩的⾼滴度载体限制了其应⽤[9]。
除此之外,VSV-G伪型LVVs可被⼈⾎清补体介导机制灭活，阻碍了它在体内基因传递的应⽤[21]。为此对⼈⾎清灭活作⽤有更强的抵抗⼒的病毒不断被发现，如可卡尔病毒(Cocal virus,CV),⾦迪普拉病毒(Chandipura virus,CNV)和⽪⾥病毒
有更强的抵抗⼒的病毒不断被发现，如可卡尔病毒(Cocal virus,CV),⾦迪普拉病毒(Chandipura virus,CNV)和⽪⾥病毒(Piry virus,PRV)[22,23]。其中CV-G与VSV-G有72%的同源性，并结合同⼀受体介导进⼊细胞，但对于转导⼈HSCs和CD4+T细胞,CV-G伪型LVVs⽐VSV-G伪型LVVs更有优势[22]。CNV-G和PRV-G伪型LVVs虽能介导来⾃不同物种的成纤维细胞和上⽪细胞的有效转导，但在⼈T细胞、NK细胞和HSCs中转导效率远低于VSV-G伪型LVVs[23]。
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洗手液机2 病毒转导增强剂
为了达到研究⽬的，在转导过程中加⼊TEs也能有效提⾼转导效率。⽬前根据TEs的作⽤机制可分为
两⼤类:⼊胞增强⼦和⼊胞后增强⼦。⼊胞增强⼦作⽤于病毒的附着或进⼊过程，通过在物理上增加病毒载体颗粒和靶细胞之间的共定位或降低它们之间的排斥⼒发挥作⽤。⽽⼊胞后增强⼦是在病毒进⼊细胞后发挥作⽤，降低细胞质中运输阻碍，最终获得更⾼的转导细胞⽐例并提⾼细胞内VCN。
2.1 ⼊胞增强⼦
聚凝胺(polybrene)是⼀种阳离⼦聚合物,1971年研究证明它可提⾼逆转录病毒的转导效率[24]。聚凝胺的确切作⽤机制尚不清楚，多认为它是通过中和细胞表⾯与病毒粒⼦之间的负静电斥⼒，使病毒粒⼦容易吸附在细胞表⾯，从⽽促进病毒转导[25,26]。在增强各种细胞的LVVs转导中，转导效率随聚凝胺浓度的增加⽽增加[26,27,28,29,30]。但转导增强的同时也会对细胞产⽣⼀定毒性作⽤，聚凝胺不仅对细胞增殖有剂量依赖性抑制作⽤，还会不同程度的影响各类细胞的⽣长潜⼒[31]。同样为阳离⼦聚合物的硫酸鱼精蛋⽩(PS)最早被美国⾷品和药物管理局批准⽤于肝素过量。1989年,Cornetta和Anderson[24]⾸次提出PS可作为聚凝胺的替代品⽤于增强病毒转导。在部分细胞的LVVs转导中, PS在不影响细胞增殖或分化潜能下使转导效率提⾼1倍，因此聚凝胺在基因中的地位逐渐被取代[31]。但PS不能增强LVVs介导的原代⼩⿏T细胞的转导，对⼈CD34+外周⾎⼲细胞转导的影响也很⼩，从⽽限制了它在⼀些基因中的应⽤[32,33,34]。此外,PS 作为较早使⽤的增强剂之⼀，也常⽤于评定其他TEs效果的联合测试。
混合罐精液衍⽣的病毒感染增强剂(semen-derived enhancer of virus infection,SEVI)是2007年在⼈类精液中发现的前列腺酸性磷酸酶(PAP)的39个氨基酸⽚段(PAP248-286)，通过形成带正电荷的淀粉样原纤维捕获HIV分⼦，中和病毒与靶细胞之间的负静电排斥促进其附着，从⽽介导病毒⼊胞[35,36]。SEVI较聚凝胺和PS增强病毒转导能⼒更强，且毒性更⼩，即便是敏感细胞也能在液体培养和集落试验中表现出正常的⽣长和分化速率[37]。Wurm等[38] 证实SEVI在不⼲扰⼩⿏及⼈胚胎⼲细胞⼲性的同时，提⾼VSV-G和RD114伪型LVVs的转导效率。在⼈原代T细胞及HSCs中SEVI对RD114伪型LVVs介导的转导增强作⽤最明显[37]。这也提⽰除了中和电荷斥⼒,SEVI还可能与包膜蛋⽩或靶细胞受体存在某种相互作⽤，从⽽促进病毒载体⼊胞。
近⼏年LentiBOOST作为⼀种⽆毒性的化学转导增强剂逐渐引起⼈们的关注。LentiBOOST是泊洛沙姆F108(poloxamer F108, ⼀种⾼分⼦⾮离⼦表⾯活性剂)和聚凝胺的复合物，通过主要成分泊洛沙姆F108与细胞膜相互作⽤降低膜黏稠度，提⾼脂质交换和跨膜转运[10, 39]。研究证实LentiBOOST在不影响转导细胞存活、增殖及分化能⼒的同时，提⾼⼩⿏T细胞、HSCs和⼈HSCs的LVVs转导效率[33]。在异种移植后免疫缺陷⼩⿏体内,LentiBOOST使再植HSCs的VCN增加2倍，且对细胞分化和植⼊⽆影响。但与异种移植相⽐,⾃体移植后LVVs转导的⼈HSCs的重建可能有所不同，其效果有待在临床试验中进⼀步研究。近期研究表明,LentiBOOST在对⼈T细胞⽆细胞毒作⽤的情况下可增强LVVs转导产⽣更多的肿瘤抗原特异性TCR(gp100TCR)T细胞，且转导后的T细胞仍能分泌TNF及IFN-γ，并对抗原阳性的肿瘤细胞具有明显的细胞毒作⽤，这⼀发现为癌症的基因提供新的优化策略[40]。
域名库2.2 ⼊胞后增强⼦
尽管病毒与靶细胞膜的结合与融合步骤有所改进，但从质膜到细胞核的运输过程中仍会受到限制。前列腺素智能电力电容器
E2(prostaglandin E2,PGE2)最初发现作为斑马鱼胚胎中HSCs动态平衡的重要调节因⼦，不仅与HSCs的长期维持相关，还能促进HSCs的⾃我更新和在免疫缺陷⼩⿏及灵长动物中的移植效果[41,42]。PGE2的作⽤机制仍不清楚,Zonari等[43]提出PGE2可能是在细胞内吞时发挥作⽤，因为PGE2可增加VSV-G假型LVVs的转导,⽽在⾮内吞依赖包膜假型的LVVs转导时未观察到转导效率的增加。PEG2在不影响细胞存活率的情况下提⾼转导细胞⽐例及细胞内VCN，并对体外增殖、集落形成能⼒及植⼊⽔平均没有影响，在免疫缺陷⼩⿏的异种移植中，也没有影响插⼊位点在原癌基因及抑癌基因周围的分布[44]。⽬前,PGE2因其⽆毒和不改变细胞⽣物学特性，已⽤于临床患者脐带⾎移植的体外调控，基于HSCs的基因有待进⼀步实践[42, 44]。
病毒载体转导靶细胞时，细胞的固有免疫也是⼀⼤障碍，特别是⼲扰素系统通过激活⼲扰素刺激基因(ISGs)或诱导⼀些内在的抗病毒因⼦，对病毒产⽣早期免疫阻断[45,46]。免疫抑制药物通过抑制固有免疫应答增强病毒转导，其中包括环孢素A(cyclosporin A,CsA)和环孢素H(cyclosporine H,CsH)。CsA可将LVVs转导HSCs效率提⾼3倍，同时不影响HSCs的集落形成能⼒，并保持其⼲细胞特性，提⾼其
在免疫缺陷⼩⿏体内的长期植⼊[47]。但这⼀作⽤是HSCs特有的,CsA会抑制LVVs对已分化造⾎细胞的转导，可能与它会破坏亲环素A(CypA)和病毒⾐壳的相互作⽤有关[47,48]。尽管有报道在CsA
LVVs对已分化造⾎细胞的转导，可能与它会破坏亲环素A(CypA)和病毒⾐壳的相互作⽤有关[47,48]。尽管有报道在CsA 存在的情况下LVVs携带的基因会整合到⼈类细胞系中基因密度较⾼的区域，但对整合图谱没有明显的影响，也未显⽰对癌症相关基因的任何偏向[47]。
CsH与CsA虽然只有⼀个残基不同，但性质和作⽤截然不同，其通过降解⼲扰素诱导的跨膜蛋⽩3(interferon induced transmembrane protein 3,IFITM3)促进病毒载体在细胞质中的转运提⾼转导效率。IFITM3可被IFN强烈上调，通过阻⽌病毒膜或含病毒的囊泡与靶细胞膜(质膜和/或内体膜)的融合，阻⽌病毒粒⼦释放到细胞质，限制病毒的复制[49,50,51,52]。包括HSCs在内的⼲细胞最近被证明对RNA病毒有天然抵抗⼒，正是由于包括IFITM在内的抗病毒ISGs基因的表达[53]。Petrillo等[54] 发现CsH在不改变亚分布及细胞周期状态情况下使LVVs转导HSCs增强10倍，是⽬前所知的最有效的病毒转导增强剂。与LentiBOOST相⽐, CsH更⼤程度的改善了再植HSCs的VCN，并使其在体内长期稳定表达[55]。不幸的是,⾼浓度的CsH会导致细胞的急性死亡[56]。因此CsH作为⼀种新型有效的转导增强剂，应进⼀步优化应⽤⽅案，在获得⾜够转导细胞的同时保证细胞数量和特性。
3 结论及展望
⽬前临床有效的基因转导需要较⾼的载体剂量，由于载体介导的p53信号级联反应，会直接影响HSCs的体外存活和它们在体内的分化能⼒[57]。因此仍需要努⼒提⾼LVVs的转导效率，即使有相对较⼩的改善，也会对转导载体浓度产⽣很⼤影响。VSV-G伪型载体具有⼴泛的宿主细胞亲和性，极⼤地促进多种细胞的转导，但由于⼀些原始造⾎细胞缺乏LDL-R，在临床应⽤中仍需强烈细胞因⼦刺激[58,59,60]。⼀些新的包膜载体，体现出⾼细胞特异性、不受⼈⾎清灭活限制等，也为体内基因传递提供新的⽅向。⽬前这些包膜伪型LVVs还没有⽤于临床试验，但通过在⽣产过程的优化终会投⼊临床应⽤。Schejtman等[61]在利⽤LVVsp47phox缺陷慢性⾁芽肿的临床前基因实验中通过LentiBOOST和PS增强实现低MOI下有效载体转导，将进⼊临床I/II期试验。细胞固有免疫对载体的限制作⽤也应受到关注。以环孢素为代表的免疫抑制剂已初步展⽰优越的转导增强能⼒，这为未来发现新的TEs提供⽅向。除此之外，基于物理作⽤机制的微流体系统为基因转导提供⼀个微环境，通过精确的调控缩短转导时间，并在减少LVVs的使⽤量的同时提⾼转导效率，代表着基因中细胞转导的特殊⼯具[62]。总⽽⾔之,LVVs的⽣产和转导已取得较⼤进展，通过不断实验和优化有助于开发有效、可持续的基因⽅案，促进临床基因的整体成功与⼴泛应⽤。
参考⽂献
赵晓煜, 徐祺玲, 赵晓东, 安云飞. 基因慢病毒载体的转导增强策略*. 中国⽣物⼯程杂志, 2021, 41(8): 52-58
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