作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 405−415/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00405
张国嘉1,2侯蕾2王庆国2徐建第3李臻2刘晓2戴绍军1
刘炜2,*
1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心 / 东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室, 黑龙江哈尔滨150040; 2山东省农业科学院生物技术研究中心 / 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室, 山东济南 250100; 3山东省水稻研究所, 山东济南250100
摘要: SOS2 (Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因, 在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐 害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过RACE的方法, 从花生叶片中分离到一长1462 bp、包含1341 bp
开放阅读框(ORF)的cDNA片段, 生物信息学分析显示, 该基因属SOS2类基因, 被命名为AhSOS2 (GenBank登录号
电磁水泵
为HG797656), 编码446个氨基酸, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量PCR分析显示, AhSOS2
在花生中为组成型表达; 且受盐胁迫及干旱诱导。经250 mmol L–1 NaCl处理后, 该基因在花生幼苗茎中被诱导表达,
表达量约是对照茎中的30倍; 而在30% PEG-6000模拟干旱处理下, 该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综
合以上结果, 显示AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前, 已成功构建了AhSOS2的植物双元表
达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株, 初步功能分析显示, 过表达AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫 的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制, 进而指导花生抗性育种及
品质改良具有重要意义。
关键词：花生; SOS2类基因AhSOS2; 荧光定量PCR; 表达特性; 抗逆; 品质改良
Cloning and Functional Characterization of Peanut Gene AhSOS2
ZHANG Guo-Jia1,2, HOU Lei2, WANG Qing-Guo2, XU Jian-Di3, LI Zhen2, LIU Xiao2, DAI Shao-Jun1, and LIU Wei2,*
水过滤板
1Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University / Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field, Ministry of Education, Harbin 150040, China; 2 Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Key Labo-ratory of Genetic Improvement, Ecology and Physiology of Crops, Shandong Province, Jinan 250100, China; 3 Shandong Rice Research Institute, Shandong Province, Jinan 250100, China
Abstract:SOS2 (Salt Overly Sensitive 2) is a kind of important salt tolerance genes, which is involved in mediating the intracel-lular ion balance and plays an important role in the response of plants to salt damage and adaptation. In this study, a 1462 bp full-length cDNA, including a 1341 bp open reading frame, was isolated and harvested by RACE method. As the gene showed more than 70% h
omologous to members of SOS2 subfamily in other plants by bioinformatics analysis, it is then named as Ah-SOS2 (GenBank accession number HG797656). Its coding protein AhSOS2 has 446 amino acids, and is a member of serine/ threonine protein kinases. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis showed that AhSOS2 was expressed constitutively in peanut tissues, and could be induced to express higher under salt and drought treatments. When treated with 250 mmol L–1 NaCl, the gene expression level increased dramatically to about 30 times higher than that of control in the stems of peanut seedlings, while the expression level of AhSOS2 increased markedly in the leaves of peanut seedlings when treated by drought stress that imitated by 30% PEG-6000. AhSOS2 is supposed to participate in stress resistance and tolerance in peanut. The expression binary vector of pCAMBIA1301P-AhSOS2 was constructed and the transgenic rice plants were obtained. The primary functional verifi-cation showed that the ability of salt tolerance and adaptation was enhanced in AhSOS2 overexpression rice. The above research is expected to uncover the adversity defense mechanisms of peanut grown under stress conditions, and further guide the resistance
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08001-010B)和山东省农业良种工程(2012–2014)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 刘炜, E-mail: wheiliu@163, Tel: 0531-********
第一作者: E-mail: zhangguojia314@163
Received(收稿日期): 2013-06-20; Accepted(接受日期): 2013-12-14; Published online(网络出版日期): 2014-01-17.
URL: wwwki/kcms/detail/11.1809.S.20140117.1627.001.html
406作物学报第40卷breeding and quality improvement of peanut.
Keywords: Peanut; SOS2 gene AhSOS2; Quantitative real-time PCR; Expression pattern; Stress resistance; Quality im-provement
土壤盐渍化是严重影响农作物生长和生态环境的非生物胁迫因素之一[1]。植物在生长过程中经常会受到高盐等不良环境影响, 导致植物水分亏缺, 进一步产生离子毒害及渗透胁迫, 从而影响植物的生长发育, 严重时会导致植物死亡[2]。植物在响应及适应盐胁迫的过程中, 形成了一系列调控机制[3], 如渗透调节、离子区域化、活性氧清除等。其中, 胁迫信号的感知和转导是引起植物产生理化响应及发生变化的关键步骤。SOS (salt overly sensitive)信号转导途径作为植物耐盐性相关的重要信号转导途径之一, 在模式植物拟南芥中已有较深入的研究。且已有证据证明, SOS信号途径除参与植物盐胁迫响应及抗逆过程外, 还可以和其他信号途径交叉成网络来共同发挥对不同生物学过程的调控作用[4-5]。SOS
剑式机器人
信号途径首先由朱健康等报道, 他们利用快中子轰击(fast neutron bombardment)、T-DNA诱变以及化学突变(如EMS诱导)等方法, 创制了大量的拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变植株, 从中筛选获得了5组盐敏感SOS突变体, 并进一步鉴定了5个SOS信号通路的基因, 即AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3、AtSOS4和AtSOS5[6-14]。其中SOS2是拟南芥中重要的耐盐基因之一[9]。SOS2对调控植物细胞中Na+、K+平衡具有重要作用, 对环境中高浓度的Na+和低浓度的K+非常敏感, 其相关突变体缺乏对盐胁迫的耐受性。拟南芥中AtSOS2基因位于5号染体上, 预期编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 其N-末端催化位点与酵母SNF1激酶和哺乳动物的AMPK激酶非常相似, 在盐胁迫下, 该基因在拟南芥根中表达明显被促进[9]。植物在受到高盐胁迫时, SOS信号通路中的SOS3作为Ca2+感受器, 能够激活体内的SOS2蛋白激酶, 并与SOS2结合形成SOS3-SOS2蛋白激酶复合物, 通过磷酸化激活SOS1, 使细胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白发挥作用, 将体内的Na+排出体外, 维持体内的离子平衡[15]。Hu等[16]从苹果中分离到CIPK基因MdSOS2, 通过序列比对和系统进化树分析, 显示该基因与拟南芥中AtSOS2基因相似性很高, 且该基因受盐胁迫诱导, 酵母双杂交试验证明, MdSOS2蛋白N-端可分别与MdSOS3和AtSOS3相互作用, 从而共同调控苹果的耐盐性。Quan等[17]通过质壁分离和GFP染技术, 证明了SOS3的同系物SCABP8/CBL10可与SOS2蛋白激酶相互作用, 且SCABP8与SOS2还可共同激活SOS1, 从而协同作用以提高拟南芥幼苗的耐盐性。花生(Arachis hypogaea L.)作为一种重要的经济和油料作物, 其产量和品质与人类生活密切相关[18-19]。
花生主要生长于干旱和半干旱地区, 对较低的叶片水势具有一定的耐受性[20]。在长期的恶劣环境及进化过程中, 其体内形成了一定的防御系统, 并选择性地积累了部分胁迫抗性基因, 在植株维持生命力及对逆境的适应中发挥了重要作用。然而, 目前有关花生耐盐抗逆及其在胁迫下体内离子稳态调节及适应机制的报道仍较少[21]。因此, 利用现代生物技术, 发掘花生抗逆相关基因并开展抗逆转基因育种具有非常重要的意义。本研究在以往对抗性SOS2类基因相关报道的基础上, 通过设计简并引物, 并结合5′Race和3′Race的方法, 从花生叶片中分离获得基因AhSOS2, 进一步利用荧光定量PCR技术, 对正常生长及胁迫处理后的花生幼苗中AhSOS2的表达特性进行了研究, 结果显示AhSOS2的表达受盐害、干旱等胁迫诱导, 暗示该基因在抗盐及抗旱过程中具有一定生物学功能。同时, 通过构建AhSOS2的植物表达载体获得了部分转基因水稻材料, 对基因功能的初步研究结果显示该基因在抗盐、抗逆过程中具有一定作用。这方面的研究成果, 预期将为揭示AhSOS2参与耐盐及抗旱过程及其调控机制, 进而完善逆境下花生生长的防御网络构建, 及花生抗性育种和品质改良提供指导。
1材料与方法
1.1 试验材料
将花生(Arachis hypogaea L.)品种鲁花14的种子置培养皿中, 光照16 h、25℃和黑暗8 h、20℃条件下浸泡2 d, 萌发后播于盛有沙石的花盆中, 充分浇水, 在温度25℃和相对湿度80%的条件下, 于温室培养1
5 d, 分别取生长一致的材料, 以浇灌及喷施的方式处理。(1)以30% PEG-6000模拟干旱, 分别处理0、3、6、12、24和48 h; (2)以250 mmol L–1 NaCl分别处理0、3、6、12、24和48 h。取每种处理的根、茎、叶、花、果针各0.2 g (其中花和果针取自大田生长植株), 经液氮速冻后, 保存于–80℃
第3期张国嘉等: 花生AhSOS2基因的克隆及功能初探407
冰箱备用。
cDNA Synthesis Kit (D6210A TaKaRa)和DNA Purification Kit (DV805A TaKaRa), 均购自大连TaKaRa公司; 高纯质粒回收试剂盒(DP1002 Bio Teke)购自北京百泰克生物技术有限公司; 大肠杆菌Trans DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司; 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成及山东省农业科学院生物技术研究中心测序。
用于基因扩增的简并引物为AhSOS2j1: 5′-CAGATHAAAAGRGAGATATCNATHATGAA-3′及AhSOS2j2: 5′-GATARKGYAATCATCTCRAANGC ATTCAT-3′; 用于扩增AhSOS2基因全长的引物为AhSOS21: 5′-GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTG T-3′及AhSOS22: 5′-TCTAGACTGGATCATACAGT CATTTGTCG-3′(下画线分别表示Kpn I和Xba I酶切位点), 用于5′ RACE扩增的2条嵌套引物为AhSOS25I: 5′-ACCGGAACATAGTTTCTCCTGAAC C-3′和AhSOS25O: CATTATCAAAGGACCTCCCTC AGTAC-3′, 用于3′ RACE扩增的2条嵌套引物为AhSOS23I: 5′-GAGG
TGCTAGGCAATCAAGGTTAT G-3′和AhSOS23: 5′-CGGATTGAGTGCATTGAC AAAGC-3′; 用于Real-time PCR的引物为Real-R: 5′-CACAGAGACTTGAAGCCT-3′及Real-F: 5′-GGA GAACATCAACACCCT-3′; 以Actin为内对照, 其引物序列为P677F: 5′-GTCATCGTCATCCTCTTCTC-3′和P677R: 5′-CATTCCTGTTCCATTGTCAC-3′。
音箱布1.2 花生RNA的提取及单链cDNA合成
参照SDS法[22]提取花生RNA, 参照cDNA Synthesis Kit (D6210A TaKaRa)合成单链cDNA, 具体操作详见其说明书。
1.3 AhSOS2基因简并序列的克隆
参考已发表的拟南芥SOS2基因序列, 结合检索NCBI (bi.v/blast/)数据库, 获得不同物种中SOS2类基因序列信息, 其中包括: 大豆(Glycine max)中的GmSOS2 (GenBank登录号为XP_003549757), 胡杨(Populus euphratica)中的PeSOS2 (GenBank登录号为ACN76476), 蓖麻(Ricinus communis)中的RcSOS2 (GenBank登录号为XP_002524508), 葡萄(Vitis vinifera)中的VvSOS2 (GenBank登录号为XP_002285262), 芥菜(Brassica juncea)中的BjSOS2 (GenBank登录号为ABM66448), 毛果杨(Populus trichocarpa)中的PtSOS2 (GenBank 登录号为XP_002324651), 百脉根(Lotus japonicus)中的LjSOS2 (GenBank登录号为BAD95978); 参考以上SOS2类基因的氨基酸序列并
设计简并引物, PCR反应条件为94℃ 3 min; 之后94℃ 30 s、50℃30 s、72℃ 1 min、共30个循环; 最后72℃ 10 min; 初步获得AhSOS2的EST序列。对扩增产物的测序结果进行BlastX分析, 以验证结果的正确性。
1.4 AhSOS2基因3′端和5′端序列的获得换面鞋
在获得AhSOS2基因EST序列的基础上, 分别设计5′Race和3′Race特异性引物, 参照试剂盒5′-Full RACE Kit (Code D315, TaKaRa)及3′-Full RACE Core Set (Code D314, TaKaRa)说明书扩增AhSOS2的5′末端和3′末端, 利用CAP3软件拼接ESTs片段, 获得AhSOS2基因电子拼接序列。
1.5 AhSOS2基因全长序列的获得
以花生叶片提取的RNA反转录获得的单链cDNA为模板, 以参照电子拼接获得的AhSOS2全长序列设计的特异性引物AhSOS21和AhSOS22进行PCR扩增, 获得AhSOS2基因的全序列, PCR反应条件为, 94℃ 3 min; 之后94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃1.5 min、共35个循环; 最后72℃ 10 min。将扩增产物进行测序和BlastX比对, 同时比对分析推导出的氨基酸序列与来源于其他物种的SOS2类基因的相应氨基酸序列。
1.6实时荧光定量PCR对基因的表达模式分析
分别提取花生根、茎、叶、花、果针的总RNA, 利用cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成单链cDNA, 根据获得的AhSOS2基因全长序列, 设计荧光定量PCR特异性引物Real-R及Real-F, 以Actin作为内对照, 反应在ABI PRISM 7900HT (Applied Biosys-tems)荧光定量PCR仪上进行, 反应体系为20 μL, 参考FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (13135900罗氏)说明书, 反应条件为95℃ 10 min; 95℃10 s; 60℃20 s; 72℃20 s; 40个循环。按照2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量。用实时荧光定量PCR法分析花生AhSOS2基因的组织表达模式、盐胁迫及干旱胁迫下的表达特性。
1.7 AhSOS2植物双元表达载体的构建及转化
1.7.1 植物表达载体的构建将PCR获得的AhSOS2基因全长序列, 与在商业化载体pCAMBIA 1301基础上外源添加CaMV35S启动子及NOS终止子改造获得的植物表达载体pCAMBIA1301P[23], 分别用Kpn I和Xba I双酶切, 回收酶切片段, 用T4DNA 连接酶连接, 获得重组质粒, 命名为pCAMBIA
408作物学报第40卷
1301P-AhSOS2, 并测序验证。
1.7.2 水稻的遗传转化将构建好的含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2, 经液氮冻融法[24]导入根癌农杆菌LBA4404所制备的感受态细胞中, 通过PCR鉴定阳性克隆。参照刘巧泉等[25]
的方法对水稻中花11愈伤组织进行遗传转化, 经共培养及抗性筛选, 目前已获得部分转基因水稻, 并对其功能进行初步分析。
1.8 转基因植株的组织化学染及PCR鉴定1.8.1 GUS组织化学染按照Jefferson[26]的方法进行GUS组织化学染分析。选取2~3 cm T1代转基因水稻叶片浸泡在预先配制好的GUS染液里, 37℃保温、染过夜, 之后用75%乙醇脱至阴性对照为白, 于体视显微镜(LEICA S-系列)下观察染结果, 照相并记录。
1.8.2 转基因植株的PCR检测以经GUS组织化学染筛选获得的阳性转基因植株为材料, 利用CTAB [27]法提取基因组DNA, 以其为模板, 以AhSOS21和AhSOS22为引物进行PCR, 确认转基因水稻。
1.9转基因水稻对盐胁迫的耐受性检测
为了测试转基因水稻对盐胁迫的耐受性, 挑取籽粒饱满的T1代转基因水稻种子, 黑暗下于培养皿中浸种2~3 d, 之后将萌动的种子移入放有水稻培养液的纸杯中, 于28℃, 16 h光照, 8 h黑暗条件下培养, 待生长7 d后, 水稻幼苗长至三叶期时分别进行0、100和250 mmol L–1 NaCl处理, 以相同处理条件下未转基因的水稻为对照, 对比观察转基因水稻和对照在盐胁迫条件下的生长状况, 及叶片的持绿性、萎蔫情况和根生长状况的异同, 并拍照记录。
2结果与分析
2.1 AhSOS2简并序列的克隆
以花生叶片提取的总RNA反转录的单链cDNA 为模板, 以简并引物AhSOS2j1和AhSOS2j2对AhSOS2的简并区域进行扩增, 获得PCR产物长度为780 bp, 与预期的大小一致(图1)。
2.2 AhSOS2基因全长序列的克隆及分析
以所获得的AhSOS2简并区序列为模板, 利用cDNA末端快速克隆技术, 设计5′ RACE和3′ RACE 特异性引物, 参照相应试剂盒说明书分别扩增AhSOS2的5′和3′末端, 扩增序列经BlastX比对验证。利用DNAMAN 5.0软件, 获得基因的电子拼接cDNA全长序列。参照拼接的基因全长序列设计特异性引物, 经RCR获得全长为1462 bp的基因AhSOS2 (图2)。将基因AhSOS2的测序结果进行BlastX比对, 结果与基因电子拼接序列基本一致。
图1利用简并引物对AhSOS2序列的PCR扩增
Fig. 1 PCR amplification of AhSOS2 with degenerate primers M: 100 bp DNA分子量; 1~3: AhSOS2在50℃、52℃和54℃解链
温度下的PCR扩增产物。
M: 100 bp DNA ladder marker; 1–3: PCR products of AhSOS2 with melting temperature (T m) at 50℃, 52℃, and 54℃.
图2 AhSOS2的全长序列扩增
Fig. 2 Amplification of full-length cDNA of AhSOS2
M: 2 kb plus DNA marker; 1~4: AhSOS2的PCR产物。
M: 2 kb plus DNA marker; 1–4: PCR products of AhSOS2.
2.3基因AhSOS2的生物信息学分析
将获得的全长为1462 bp的AhSOS2的cDNA序列经NCBI (ih.gov/) BlastX分析显示, AhSOS2基因包含一个1341 bp的开放阅读框, 110 bp的5′端非翻译区, 及11 bp的3′端非翻译区。利用在线网站Expasy (/tools/ protparam.html)对AhSOS2基因进行生物信息学分析, 结果显示, 花生AhSOS2基因编码446个氨基酸残基, 分子量为51 kD, 等电点为8.68。
同时, 利用在线网站Expasy (pasy. org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1)对该基因氨基酸序列的亲水性/疏水性分析, 由图可看出(图3), AhSOS2编码蛋白的疏水区和亲水区交替出现, 依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律, 在整个肽链中, 亲水性氨基酸均匀分布, 且多于疏水性氨基酸。因此, 整个多肽链表现为亲水性, AhSOS2蛋白为亲水性蛋白。
医用手腕带第3期
张国嘉等: 花生AhSOS2基因的克隆及功能初探 409
利用SMART (bl-heidelberg.de/)网站, 对AhSOS2蛋白的结构域预测发现, AhSOS2蛋白在第11到264氨基酸之间含有一个S_TKc 保守结构域, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区(图4)。采用在线蛋白质序列信号肽分析工具Sigalp4.1对AhSOS2分析显示(图略), 蛋白N 端无信号肽, 推测AhSOS2蛋白属非分泌型蛋白。利用TMHMM (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)工具分析显示(图略), AhSOS2无跨膜结构域, 这一特征与蛋白激酶无跨膜结构域相吻合, 暗示该蛋白在细胞内不会发生迁移。
花生AhSOS2蛋白序列经Blastp 比对, 获得一系列同源性较高的蛋白序列, 其中选取注释为SOS2类的蛋白序列, 利用DNAMAN5.0软件与AhSOS2序列进一步比对(图5)显示, AhSOS2与番茄中的SOS2类蛋白的相似性达到了76%, 与陆地棉、拟南芥、芥菜和大豆中相应序列的相似性分别达到了75%、75%、71%和50%。
图3 AhSOS2基因的疏水性/亲水性分析
Fig. 3 Hydrophobicity/hydrophilicity analysis of AhSOS2
图4 SMART 网站对AhSOS2蛋白结构域预测
Fig. 4
Domain prediction of AhSOS2 by SMART analysis
图5 花生AhSOS2编码氨基酸序列与其他物种中SOS2类基因编码的氨基酸序列的比对分析 Fig. 5 Comparison of amino acid sequences of SOS2 between Arachis hypogasa and some other species
AtSOS2: 拟南芥(Arabidopsis thaliana ); GmSOS2: 大豆(Glycine max ); GpSOS2b: 陆地棉(Gossypium hirsutum ); BjSOS2: 芥菜(Brassica juncea ); SlSOS2: 番茄(Solanum lycopersicum )。
AtSOS2: (Arabidopsis thaliana ); GmSOS2: soybean (Glycine max ); GpSOS2b: cotton (Gossypium hirsutum );
BjSOS2: mustard (Brassica juncea ); SlSOS2: tomato (Solanum lycopersicum ).
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