肠道菌和短链脂肪酸的影响
■舒均兰1
徐娥1*桂国弘2肖明飞1肖英平3唐青松1
（1.贵州大学动物科学学院，动物营养与饲料研究所，贵州贵阳550025；2.贵州省农业职业学院，贵州贵阳551400；
3.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州310021）
摘要：试验旨在研究丁酸梭菌（Clostridium butyricum ）早期干预对产肠毒素大肠杆菌（Entero⁃toxigenic Escherichia coli ，ETEC ）攻毒肉仔鸡肠道短链脂肪酸（SFAs ）和菌结构的影响。选用1日龄ROSS 肉仔鸡200只，分为两组，每组100只，试验前3d ，其中一组每天灌喂1mL 浓度为109CFU/mL 的丁酸梭菌，另外一组灌喂1mL 生理盐水。7日龄时，将灌喂生理盐水的肉仔鸡分成对照组（Control ）和大肠杆菌组（EC ）；灌喂丁酸梭菌的肉仔鸡分成丁酸梭菌组（CB ）和丁酸梭菌+大肠杆 菌组（CB+EC ）。7日龄至试验结束，EC 组和CB+EC 组灌喂1mL （108CFU/mL ）产肠毒素大肠杆菌菌液进行攻毒，Control 组和CB 灌喂1mL 生理盐水。ETEC 攻毒后第3d 和7d 屠宰取样。结果显示：①在肉仔鸡盲肠中，10日龄时，与Control 组相比，CB 组中乙酸含量极显著提高（P <0.01），EC 组中的乙酸含量显著降低（P <0.05）；CB 组和CB+EC 组中丁酸的含量较为相近，均极显著高于Control 组和EC 组（P <0.01）。14日龄时，与Control 组相比，CB 组中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量均显著提高（P <0.05），EC 组中的乙酸、丙酸、丁酸显著降低（P <0.05）。②10日龄时，在CB 组中，瘤胃球菌属相对丰度最高，显著高于其他各试验组（P <0.05）。由此可见，丁酸梭菌早期干预大肠杆菌攻毒的肉仔鸡可一定程度上促进肠道短链脂肪酸的生成和改善盲肠菌结构。
关键词：丁酸梭菌；肉仔鸡；大肠杆菌；短链脂肪酸；菌结构doi:10.13302/jki.fi.2021.11.008中图分类号：S816.3文献标识码：A 文章编号：1001-991X （2021）11-0044-09Effects of Early Clostridium Butyricum Intervention on Short-chain Fatty Acid and Microbial Community Structure in Broiler Chickens Challenged with Enterotoxigenic Escherichia coli
SHU Junlan 1XU E 1*GUI Guohong 2XIAO Mingfei 1XIAO Yingping 3TANG Qingsong 1
(1.College of Animal Science,Guizhou University ,Institute of Animal Nutrition and Feed Science ,Guizhou Guiyang 550025,China ;2.Guizhou Vocational College of Agricultural ,Guizhou Guiyang 55
1400,China ;3.Agricultural Product Quality Standard Institute of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences ,Zhejiang
Hangzhou 310021,China )
Abstract ：This study aimed to study the effect of early Clostridium butyricum (CB)intervention on the in⁃testinal short-chain fatty acid (SCFA)content and microbial community structure in broiler chicken challenged with Escherichia coli (EC).In this study,two hundred one-day-old ROSS broilers were se⁃lected and randomly divided into two groups.During the first 3days,one group was given 1mL of CB (109CFU/mL)every day,and the other was given 1mL of normal saline.At the age of 7days,broilers fed with saline were divided into control group (CON)and Escherichia coli group (EC).Broilers fed CB
were divided into CB group and CB +EC group.When the age of 7days to the end of the experi⁃ment,1mL (108CFU/mL)enterotoxin-producing EC was given to EC group and CB+EC group for challenge,while 1mL normal saline was given to CON group and CB group.The samples contents
作者简介：舒均兰，研究方向为动物营养与饲料科学。
*通讯作者：徐娥，博士，副教授。
收稿日期：2021-03-26
基金项目：国家自然科学基金[31402083、31972999]
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产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）极易引起初生畜禽腹泻、肠道疾病甚至死亡，一直以来是制约畜禽健康高效养殖的重大因素。以往常用抗生素或控制大肠杆菌引起的负面影响，近年随着抗生素耐药性和残留问题的日益凸显，全球限制了抗生素在畜禽业上的使用。丁酸梭菌是益生菌中重要一员，近年普遍研究表明，丁酸梭菌具有显著的抗炎、调节肠道菌、增强免疫力等生物学功能[1-5]。此外，丁酸梭菌还可促进机体短链脂肪酸、乳酸和消化酶等物质生成，并且通过调节肠道菌、促进免疫防御因子分泌来改善畜禽健康[6]。Yang等[7]研究表明，在饲粮中添加丁
酸梭菌可降低肉鸡盲肠中大肠杆菌的数量，提高肉鸡盲肠中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。申露露等[8]研究表明，丁酸梭菌早期干预可降低大肠杆菌攻毒肉鸡肠道炎症因子和抗菌肽基因的表达，并降低了雏鸡的下痢。Zhang等[2]研究表明，饲粮添加丁酸梭菌可改善大肠杆菌攻毒肉鸡的生长性能、肠屏障功能和消化酶活性。然而，丁酸梭菌早期干预对大肠杆菌感染肉鸡的肠道短链脂肪酸含量的影响还未见相关报道，早期干预对肠道菌的研究也较少。因此，本试验研究了丁酸梭菌对肉仔鸡大肠杆菌感染攻毒后肠道短链脂肪酸含量和菌结构的变化，以期为肉鸡乃至家禽养殖生产中丁酸梭菌防治大肠杆菌病提供科学依据。 1材料与方法
1.1试验动物与菌种
试验1日龄肉仔鸡为ROSS308肉鸡，购至江苏镇江腾达孵化厂。试验用丁酸梭菌（编号：MIYAIRI
II588）购于日本米雅利桑株式会社。产肠毒素大肠杆菌K88（编号：CVCC1556）购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
1.2试验设计
爬楼购物车试验选取200只健康状况良好的1日龄ROSS308肉仔鸡，根据体重无差异原则随机分为2组，每组100
只鸡，分别为对照组（Control组）和丁酸梭菌组（CB组）。试验开始后1~3d，每天对Control组的仔鸡灌喂1mL 生理盐水，CB组仔鸡灌喂1mL浓度为109CFU/mL的丁酸梭菌菌液，在第7d时把CB组再随机分为丁酸梭菌组（CB组）和丁酸梭菌+大肠杆菌组（CB+EC组），同时将Control组也随机分成对照组（Control）和大肠杆菌组（EC组），每组50只仔鸡。EC组和CB+EC组7日龄至试验结束每天对仔鸡灌喂1mL浓度为108CFU/mL 的大肠杆菌菌液，Control组和CB组7日龄至试验结束每天对仔鸡灌喂1mL生理盐水，试验期为14d。试验设计和分组情况如表1所示。
1.3饲养管理
试验地点为浙江省农业科学院动物试验基地。试验开始前对动物房舍、饲养设备进行检查和严格的消毒处理，动物房室内的温度利用白炽灯调节，第一周温度保持在37℃，之后每周逐渐降低2~3℃，直到与室温一致，保持24h光照。试验肉仔鸡自由采食和自由饮水，人工投料，每天投喂3次。基础日粮组成及其营养水平见表2。
were collected at3d(10days old)and7d(14days old)after ETEC challenge.①In cecum of broilers at10days of age,compared with CON group,acetic acid content in CB group was significantly increased (P<0.01),and acetic acid content in EC group was significantly decreased(P<0.05);the content of butyr⁃ic acid in CB group and CB+EC group was similar,and was significantly higher than t
hat in CON group and EC group(P<0.01).At14days of age,compared with CON group,the contents of acetic acid,propi⁃onic acid,butyric acid and isobutyric acid in CB group were significantly increased(P<0.05),while the contents of acetic acid,propionic acid and butyric acid in EC group were significantly decreased(P< 0.05).②At10days of age，The CB group had the highest relative abundance of[Ruminococcus] _torques_group,which was higher than other groups(P<0.05).Therefore,early Clostridium butyrate inter⁃vention in broiler chickens challenged with Escherichia coli could promote the production of SCFA and improve the structure of cecum flora to a certain extent.
whca
Key words：Clostridium butyricum;broiler chicken;Escherichia coli;short-chain fatty acid;microbial community structure
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表1
试验处理情况
表2基础日粮组成及营养水平（风干基础，%）
注：1.预混料为每千克日粮提供:VA15000IU、VD31263 VB120.1mg、泛酸钙28mg、烟酸60mg、叶酸2mg、生物素0.3mg、氯化胆碱800mg、Fe80mg、Cu10mg、Zn85mg、Mn100mg、I1.5mg、Se0.5mg、Co0.4mg；
2.营养水平均为计算值。
1.4样品采集和保存
在肉仔鸡的10、14日龄时，每组随机抽取8只肉仔鸡进行屠宰，分别收集回肠和盲肠中段内容物于5m
L离心管，液氮保存，采样完毕后保存至-80℃超低温冰箱用于提取细菌DNA。
1.5短链脂肪酸的测定
称取0.1g的盲肠内容物于离心管中，加入9倍体积（mL）的PBS溶液混合均匀，12000r/min离心10min，取上清液500μL，加入100μL的25%（质量体积比）偏磷酸巴豆酸混合液，涡旋混匀，于-20℃冰箱过夜保存24h。上机前，12000r/min离心10min 取上清液于0.22μm滤膜过滤，取150μL于进样瓶，于气相谱仪测定SCFAs含量。谱条件为：谱柱温度70℃；使用FID1检测器；检测温度250℃；载气为氮气；压力为37.5kPa；氧气压力50kPa，氢气50kPa，灵敏度为10-1，衰减3.0。
锅炉冷渣机
1.6粪便DNA提取和高通量测序分析
粪便DNA参照QIAGEN公司（QIAGEN，German）试剂盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit的操作步骤进行提取。并以提取的DNA为模板，引物为338F(5′ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′GGAC⁃TACHVGGGTWTCTAAT-3′)，对细菌16SrRNA基因V3~V4区进行PCR扩增。采用双端测序法（Pair end, 250bp×2），Hiseq2500平台进行PE250测序。1.7数据处理与统计分析
使用Uparse软件（Uparse V7.0.1001）依据相似性≥97%将质控后的有效序列聚类成为操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。采用QIIME（Ver⁃sion1.7.0）默认参数计算各样品的alpha多
样性指数（包括菌丰度指数Ace和Chao分析，菌多样性香农指数Shannon和辛普森指数Simpson分析以及覆盖度指数Good coverage分析）和物种分布。为了比较使用BPW增菌剂增菌不同时间的菌结构差异，使用R 软件（Version2.15.3）内的FactoMineR软件包对样品之间的菌结构相似度进行主坐标分析（PCoA）。短链脂肪酸和肠道菌相对丰度的结果均使用SPSS分析，SPSS18.0分析实验数据的显著性。结果以“平均值±标准误（Mean±SEM）”表示，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。
2结果与分析
2.1回肠与盲肠内容物短链脂肪酸的含量
手提把从表3可知，在肉鸡第10日龄（攻毒3d后）和第14日龄（攻毒7d后）的回肠中，其短链脂肪酸的含量非常少，各组间均差异不显著（P>0.05）。
由表4可知，在肉仔鸡盲肠中，10日龄时，与Con⁃trol组相比，CB组中乙酸含量极显著提高（P<0.01），EC 组中的乙酸含量显著降低（P<0.05）；CB组和CB+EC组中丁酸的含量较为相近，均极显著高于Control组和EC
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表4
丁酸梭菌对肉鸡不同天数盲肠内容物短链脂肪酸含量的影响(mg/g)
组（P <0.01）。14日龄时，与Control 组相比，CB 组中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量均显著提高（P <0.05），EC 组中的乙酸、丙酸、丁酸显著降低（P <0.05）。2.2盲肠内容物细菌高通量测序
试验第10日龄和14日龄肉仔鸡盲肠菌结构的测定使用高通量测序技术，结果如表5所示，第10日龄和、第14日龄肉仔鸡各组分别平均获得371~405、
375~651个OUT ，各样品覆盖度指数（good coverage ）在0.998以上。结果表明，已基本全部测出样品中序列。并且通过作出稀释性曲线图观察，如图1所示，所有样品的测序曲线趋向平坦，可说明此次测序量结果合理，并得出测序深度为63390
次。
表3丁酸梭菌对肉鸡不同天数回肠内容物短链脂肪酸含量的影响(mg/g)
注：同行数据肩标字母相同或无字母表示差异不显著(P >0.05)，小写字母不同表示差异显著(P <0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P <0.01)；
下表同。
表5不同天数各组盲肠内容物16S rRNA 测序结果
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观测到的O T U 数量
梨花护肤品
10000
500006000070000
800
600
400
200
20000
3000040000随机抽取的测序数据量
图1稀释曲线
如图2所示，肉仔鸡盲肠第10日龄时各组均以厚壁菌门（Fimicutes ）为主要门类，相对丰度占比均在90％以上，其次为变形菌门（Proteobacteria ）、放线菌门（Actinobacteria ）柔壁菌门（Tenericutes ）。如图3为10日龄肉鸡盲肠属水平相对丰度，各组主要以乳酸菌属、毛螺菌科、瘤胃
球菌属、丁酸球菌属、魏斯氏菌属
（Weissella ）、芽孢杆菌属（Bacillus ）等为主要菌。
肉仔鸡14日龄时，各组的菌结构发生了变化，在门水平上（见图4），在各组主要以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门（Bacteroidetes ）、放线菌门以及蓝藻门（Cynaobacteria ）为主。在属水平上，由图5显示的各菌属占比可知，乳酸菌属、瘤胃球菌属、毛螺菌科、瘤胃球菌科、柔嫩梭菌属（Faecalibacterium ）、丁酸球菌属、
芽孢杆菌属等为其主要的菌属。
相对丰度(%)
C o n t r o l 10-1
10080
604020
C o n t r o l 10-2
C o n t r o l 10-3
C o n t r o l 10-4
C B 10-1
C B 10-2
C B 10-3
弧面凸轮
C B 10-4
E C 10-1
E C 10-2
E C 10-3
E C 10-4
C B +E C 10-1
C B +E C 10-2
C B +E C 10-3
C B +E C 10-4
图2第10日龄肉鸡盲肠内容物菌结构（在门水平上）
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