有机污染物高效液相谱分析技术-（1）紫外-可见光检测器分析酚类化合物
一、实验目的
1、掌握高效液相谱分析法中的基本原理（包括分配分离原理、紫外-可见光检测器检测原理）； 2、基本了解高效液相谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作；
3、了解紫外-可见光检测器的基本原理及其适用范围；
4、掌握高效液相谱定性、外标定量方法。
二、实验原理
液相谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。高效液相谱仪以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主谱分离技术，在基本理论方面与气相谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相谱相比，高效液相谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相谱法的不足。
对于酚类化合物的测定，其基本原理是这样的：先用固相小柱吸附水中酚类化合物，然后用溶剂洗脱，经氮吹气浓缩至一定体积后，用反相高压液相谱法分析。在反相谱柱上以甲醇/（水+乙酸）为流动相把经预处理的酚类化合物分离，用紫外检测器，测定各
种酚的峰高或峰面积，以外标法定量。
分配谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相谱分离模式。
1、高效液相谱的组成结构及各部分作用
（1）四元泵：混合、脱气作用。
四元泵真空脱气机由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个真空泵构成。打开真空脱气机的电源开关后，控制电路即开启真空泵，真空泵运行使真空箱内产生部分真空。真空度由压力传感测定，根据传感器信号，真空脱气机通过运行或关闭真空泵来维持真空度。
（2）自动进样器
（3）柱温箱：
（4）UV-VIS检测器
（5）C18谱柱：分离样品中的各个物质。
流动相——真空在线脱气机——四元比例阀——主动输入阀——泵头——出口单向阀——压力阻尼器（侧压力）——泵头——排液阀——自动进样器（其冷凝水排水管必须高
于收集瓶，不能浸在液体里。其下有一控温模块，定量环标配100ul，一般进样量5ul-
50ul较好）——柱温箱——紫外监测器（流通池）——荧光检测器（一定要荧光串联在紫外之前，因其流通池耐压20bar，紫外可耐压40bar）
2、工作过程
Agilent 1200 LC液相谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流
动相将样品带入谱柱，在谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依
次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。
3、紫外-可见光（UV-VIS）检测器
基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。（Agilent 1200
UV-VIS检测波长范围为190nm-600nm）
4、外标法定量
外标法是谱分析中一种简便的定量方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都
能被检测而得到谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据
是被测物质的量与它在谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可
led闪光灯以给出包括峰高和峰面积在内的多种谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标
准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。
5、液相谱分离模式
（1）正相谱法
采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性
溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、等以调节
组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨
基酸类等）。
（2）反相谱法
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异
丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性
较弱的化合物。RPC在现代液相谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%
左右。
往复锯片表1 正相谱法与反相谱法比较表
正相谱法反相谱法
固定相极性高～中中～低
流动相极性低～中中～高
组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出
三、仪器及试剂
1、仪器
Agilent 1200 HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 UV-VIS检测器、C18谱柱（4.6*150mm，5um）)，稳压电源。
2、试剂
谱级甲醇；Miniport超纯水；含3个酚类化合物的标准样品；实际测试水样（配制）
四、测定方法设置
（1）自动进样器：“Injection with Needle Wash”，进样量10μL；
（2）泵参数：流速1mL/min，运行时间11min，甲醇：水=75:25；
（3）柱温箱参数设定：柱温箱35℃；
（4）VWD检测器参数设定：检测波长220nm；
五、实验步骤
1、准备
谱实验报告3
（1）根据待测物要求配制多个浓度点标准样品，并对样品做好预处理。标样浓度分别为
4ppm，6ppm，8ppm，10ppm，12ppm；
微孔抛光镜面加工（2）实验前流动相提前配好过滤脱气，并正确置换流动相；
（3）检查管路是否连接完整、检测器是否正常工作
（4）检查废液瓶是否够用。
2、样品分析
（1）打开HPLC工作站（包括计算机软件和谱仪），连接检测系统；阿比丹 艾山
（2）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在
泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。
（3）配置仪器，打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡：首先打开排气阀—按PURGE
键进行排气结束后—按STOP键停止—再拧紧排气阀—按PUMP键让泵运行；
（4）打开电脑打开在线工站选择对应的通道，输入实验信息方法、包括采样控制，积分
和仪器条件，建立平衡柱子分析方法，保存并运行；
（5）然后点数据采集，先走基线，大约1个小时左右基线基本稳定（就是基本成直线，
因为检测器打开后需要一定的稳定时间，检测器基本稳定泵里面的流动相同时也就置换好了），柱子平衡了，就可以进样了。
（6）脱机状态下建立样品分析方法，设置自动进样器方法，设置数据保存文件；
（7）运行所设置的序列方法，分析标准样品和实际样品。具体可分为单个进样和序列进样；
（8）建立清洗及保存柱子的方法，并在样品分析结束后运行。谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙睛/甲醇适于反相谱柱，正相谱柱用相应的有机相）。
（9）所有程序都结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭电脑、机器；
3、数据处理
可在脱机状态下处理实验数据
（1）从“View”菜单中，点击“Data analysis”进入数据分析画面；
（2）从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，则数据被调出；
防尘机箱
（3）从“Integration”菜单中选择“Integration Events”选项。选择合适的“Slope sensitivity”，（4）“Pea
k width”，“Area reject”，“Height reject”；
（5）从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分；
（6）如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
六、实验数据记录
1、标样数据记录
台风实时定位系统
2、样品数据
七、数据处理与实验报告
1、定性分析
谱实验报告5
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