一种绿荧光纳米球、制备方法和应用与流程

1.本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种绿荧光纳米球、制备方法和应用。

背景技术：

2.现有技术中，荧光金纳米簇auncs是近几年出现的一种荧光纳米材料，它是由几个到几百个原子组成的粒径为0.2～3nm的核壳型纳米材料，具有较强的光致发光、良好的光稳定性、大的斯托克斯位移等特点，已成功被用于过氧化氢、重金属离子、茶多酚等物质的检测。其中，以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶att和精氨酸arg为配体的荧光金纳米簇具有高量子产率、超强绿荧光等更优的性能，有望成为一种的标记材料用于免疫分析检测中，但是由于粒径超小、纯化难度大、且荧光强度易受溶液中金属离子、ph等影响的缺点，严重影响免疫分析检测技术的稳定性、准确性，限制了荧光金纳米簇的应用范围。因此，增加荧光金纳米簇的粒径和提升其稳定性是拓宽其应用场景的重要途径。
3.二氧化硅纳米颗粒具有电负性强、分散度高、稳定性好等特点，已有研究用于作为荧光量子点的载体，制备了粒径均一、荧光强度高、稳定性好、表面功能化程度高的量子点微球，并作为免疫分析技术的荧光标记材料，应用于新冠病毒抗原、抗体的检测。相比于二氧化硅微球，树枝状介孔二氧化硅纳米粒子(dmsn)不仅具有三维树枝状骨架和大的中心径向发射介孔结构，而且其孔表面结构多变，有更大的比表面积和更高的负载能力，作为载体能够有效负载大分子蛋白、小分子药物及发光化合物。因此，将dmsn作为荧光金纳米簇载体制备荧光纳米球，可以有效提高荧光金纳米簇的光学性能和稳定性，同时能够拓宽其应用范围。

技术实现要素：

4.为了克服现有技术存在的上述问题，本发明提供绿荧光纳米球、制备方法和用途，用于解决现有技术中存在的上述问题。
5.一种绿荧光纳米球的制备方法，所述方法包括以下步骤：
6.s1.分别配制绿荧光金纳米簇auncs溶液、树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn溶液和聚醚酰亚胺pei溶液；
7.s2.向dmsn溶液中加入pei溶液混合均匀并进行超声反应，即得表面包被有pei的dmsn混合溶液；
8.s3.将步骤s2中得到的混合溶液离心分离并复溶后，加入auncs溶液混匀并进行超声反应，多次离心纯化，去除溶液中未结合的auncs，制得绿荧光纳米球dmsn@auncs。
9.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，采用ph＝10的氢氧化钠水溶液配置auncs溶液、dmsn溶液和pei溶液，在避光条件下进行超声反应。
10.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述步骤s1中树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn的制备包括如下步骤：
11.s11.将三乙醇tea添加到水中，搅拌加热，得到混合溶液；
12.s12.将十六烷基三甲基氯化铵ctac和水杨酸钠加入上述混合溶液中，反应一段时间，逐滴加入硅酸四乙酯teos持续反应10-14h；
13.s13.收集s12反应所得产物并用乙醇和水交替离心洗涤，最终得所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn。
14.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，还包括将最终得所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn分散在含盐酸的甲醇中，并在40-60℃下萃取。
15.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述s1中所述绿荧光金纳米簇auncs溶液的制备包括如下步骤：
16.s21.将溶解在naoh溶液中的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶att和氯金酸按一定的体积比混合，静置反应后得att@auncs溶液，采用纯水透析进行纯化；
17.s22.将精氨酸arg溶液添加到纯化后的att@auncs溶液中，反应12-36小时，采用纯水透析进行纯化，制得绿荧光金纳米簇auncs溶液。
18.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶att和氯金酸arg的体积比为1：1-1：3；氯金酸arg溶液和透析后的att@auncs溶液的体积比为1：8-1：10。
19.本发明还提供了一种绿荧光纳米球，所述绿荧光纳米球采用本发明所述的制备方法获取。
20.本发明还提供了一种的绿荧光纳米球作为检测探针的应用。
21.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述绿荧光纳米球用于基于抗原抗体特异性识别的荧光免疫层析方法中。
22.如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述绿荧光纳米球用于基于抗原抗体特异性识别的荧光免疫层析方法中，包括如下步骤：(1).根据待层析的样品中的目标物，确定特异性抗体；
23.(2).然后将特异性抗体与绿荧光纳米球偶联成为检测探针；
24.(3).在样品中加入检测探针，孵育反应一段时间后得混合物；
25.(4).将所述混合物滴加在免疫层析试纸静置层析反应一段时间，再在免疫层析试纸条的检测区域和质控区域滴加arg溶液，实现样品中目标物的检测。
26.本发明的有益效果
27.与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
28.本发明提供的制备方法操作简单、成本低廉、反应条件温和、绿环保，所制备得到的绿荧光纳米球dmsn@auncs复合材料可作为荧光检测探针用于免疫学检测领域；根据绿荧光纳米球dmsn@auncs上标记的抗体和抗原的不同，可以形成多种荧光检测探针用于检测不同的目标物分子，在多残留高通量检测等方面有着很高的推广应用价值。
附图说明
29.图1为本发明绿荧光纳米球dmsn@auncs的制备方法的流程图；
30.图2为本发明制备的绿荧光纳米球dmsn@auncs的透射电镜图；
31.图3为基于抗原抗体特异性识别的荧光免疫层析方法的原理图；
32.图4为基于绿荧光纳米球dmsn@auncs的荧光免疫层析方法定性检测afp的结果
图。
具体实施方式
33.为了更好的理解本发明的技术方案，本发明内容包括但不限于下文中的具体实施方式，相似的技术和方法都应该视为本发明保护的范畴之内。为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
34.应当明确，本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
35.在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
36.如图1所示，本发明的绿荧光纳米球的制备方法，所述方法包括以下步骤：s1.分别配制绿荧光金纳米簇auncs溶液、树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn溶液和聚醚酰亚胺pei溶液；
37.s2.向dmsn溶液中加入过量pei溶液混合均匀并进行超声反应，pei可以在通过静电相互作用吸附在dmsn的表面，经过pei表面改性的dmsn表面显正电性，获得表面包被有pei的dmsn混合溶液。
38.s3.将步骤s2中得到的混合溶液离心分离并复溶后，加入auncs溶液混匀并进行超声反应，多次离心，加水复溶纯化材料，去除溶液中未结合的auncs，获得绿荧光纳米球dmsn@auncs，如图2所示。
39.本发明的上述方法步骤，其中，绿的荧光金纳米簇auncs、pei和dmsn通过层叠法组装而成；具体是先在带有负电的dmsn表面修饰一层带有正电的pei，然后加入带有负电的荧光金纳米簇auncs通过静电相互作用将其修饰固定在dmsn上，从而制得绿荧光金纳米球。
40.优选地，在上述的制备方法中，步骤s1中，采用ph＝10的氢氧化钠水溶液配置auncs溶液、dmsn溶液和pei溶液，在避光条件下进行超声反应。
41.优选地，在上述的制备方法中，步骤s2中，所述dmsn溶液的浓度为0.05mg/ml，pei浓度为0.2mg/ml。
42.优选地，在上述的制备方法中，步骤s2和s3中，所述超声反应的条件如下：
43.温度为室温，超声功率为36w；时间为40min。
44.优选地，上述的制备方法中，步骤s1中，所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn固体的制备包括如下步骤：
45.s11.将130-140mg三乙醇胺(tea)添加到30-60ml水中，搅拌加热至80℃，搅拌速率为600-1000rpm；
46.s12.将750-800mg十六烷基三甲基氯化铵(ctac)和300-350mg水杨酸钠加入上述混合溶液中，反应1小时，逐滴加入6-10ml硅酸四乙酯(teos)持续反应10-14h在三乙醇胺tea作为催化剂、teos作为二氧化硅源、ctac作为阳离子表面活性剂和水杨酸钠作为阴离子表面活性剂在水性介质中通过表面活性剂导向的溶胶-凝胶工艺制备dmsn；
47.s13.收集上述反应所得产物并用乙醇和水交替离心洗涤3次，去除多余的tea、teos，获得dmsn固体；
48.s14.通过将固体dmsn分散在含8-12％v/v盐酸的甲醇中并在40-60℃下萃取2小时来去除残留的表面活性剂，然后在60-110℃的烘箱内将材料烘干以获得高纯度的dmsn。
49.优选地，步骤s1中，所述绿的荧光金纳米簇auncs溶液的制备包括如下步骤：
50.s21.将溶解在naoh溶液中的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶att和氯金酸按一定的体积比混合，静置反应1-2小时后得att@au溶液，采用纯水透析进行纯化；
51.s22.将精氨酸arg溶液添加到纯化后的att@au溶液中，并在37℃下反应12-36小时，采用纯水透析进行纯化，制得auncs溶液。将auncs溶液储存在4℃避光环境中，用于防止纳米簇发生光漂白。
52.优选地，本发明提供的绿荧光纳米球dmsn@auncs能够作为荧光检测探针应用于基于抗原抗体特异性识别的荧光免疫层析方法中。
53.在荧光免疫层析方法中，按照如下步骤进行：
54.(1).根据待层析的样品中的目标物，确定特异性抗体；
55.(2).将特异性抗体与绿荧光纳米球偶联成为检测探针；
56.(3).在样品中加入检测探针，孵育反应3-5分钟；
57.(4).将所述混合物滴在免疫层析试纸条的加样孔中，静置层析反应10-15分钟，再在免疫层析试纸条的检测区域和质控区域滴加arg溶液，在紫外灯下观察结果，根据荧光强度定性检测样品中目标物的浓度。
58.上述荧光免疫层析试纸条由样本垫、结合物垫、硝酸纤维素膜(nc膜)、吸水纸、粘性底板等构成。
59.荧光金纳米簇和dmsn与pei表面电性相反，所以本发明同时将荧光金纳米簇和dmsn作为组分，合成绿荧光纳米球dmsn@auncs即可以达到富集荧光纳米簇便于纯化的目的，同时实现绿荧光纳米球dmsn@auncs标记单克隆抗体，因为反应条件温和、绿无污染，参与反应的有机组分的性质都不受影响，所以本发明方法有效解决了荧光金纳米簇作为荧光标记物在免疫检测中标记效率不高、稳定性不好等问题。
60.实施例1：制备绿荧光纳米球溶液
61.所有玻璃仪器经王水浸泡24小时后，用蒸馏水冲洗干净。首先，用超纯水分别配制荧光金纳米簇auncs(40mm)，dmsn(1mg/ml)和pei(10mg/ml；ph＝10)溶液。其次，将2ml dmsn溶液(1mg/ml)加入40ml naoh水溶液(10-4
m)中，混匀后加入800μl pei(10mg/ml)溶液混匀并在超声条件下反应40min，6000rpm离心6min，弃上清，沉淀用超纯水复溶、离心、洗涤3次，得到被pei修饰的dmsn。再次，将被pei修饰的dmsn材料用40ml的naoh水溶液(10-4
m)复溶后，加入auncs(40mm)溶液120μl超声反应40min。最后，通过多次离心纯化，加水复溶至总体积为100μl，制备得到绿荧光纳米球dmsn@auncs溶液(固体含量约2％)，在紫外灯照射下发出强烈的绿荧光。该材料生产成本低，工艺简单，由于dmsn巨大的比表面积、pei的强表面正电性、auncs的高荧光量子产率及丰富的功能基团，使制得的绿荧光纳米球具有稳定性、分散度高、光学信号强、易于修饰等优点，有望成为一种的荧光标记纳米材料。
62.实施例2：检测探针的制备
63.先用超纯水分别配制绿荧光纳米球dmsn@auncs溶液和抗甲胎蛋白afp单克隆抗
体溶液，用于检测探针的制备。将浓度为7.5μg/ml的抗afp单克隆抗体溶液加入到dmsn@auncs溶液中(终浓度为20μg/ml)，混匀后，放在室温下避光摇匀(30rpm)反应60min，再加入50μl1％聚乙二醇20000(peg
20000
)，避光摇匀反应15min，再加入100μl牛血清白蛋白(bsa)溶液(w/v为10％)，避光摇匀反应15min，形成可用于afp检测的荧光检测探针；最后通过离心弃上清，荧光检测探针用200μl复溶液重悬，避光保存备用。
64.实施例3：免疫层析试纸条的制备
65.免疫层析试纸条主要由硝酸纤维素膜(nc膜)、样品垫、结合物垫、吸水纸、粘性底板等部分组成。具体操作如下：将抗afp抗体和羊抗鼠igg分别用磷酸盐缓冲液(pbs)稀释至0.6mg/ml和0.2mg/ml，并通过划膜仪以1μl/cm的喷量分别将两种抗体稀释液划在nc膜上作为检测线(t)和质控线(c)，37℃干燥12h后，将nc膜、样品垫、结合物垫、吸水纸依次粘贴在粘性底板上，裁切成3mm左右宽的免疫层析试纸条，用于样品中目标物afp的检测。
66.实施例4：基于绿荧光纳米球的免疫层析
67.基于绿荧光纳米球的免疫层析技术检测afp的基本原理如图3所示。具体操作如下，afp国家标准物质用磷酸盐缓冲溶液(pbs)稀释成0、2.2、4.5、9.1、18.2、36.5μg/l等不同浓度；分别取80μl不同浓度的afp标准物质稀释液，作为含有目标物afp的样品，在样品中加入6μl荧光检测探针，反应3min后，滴加在免疫层析试纸条的加样孔中，静置层析10min后，在nc膜上滴加5μl的精氨酸溶液(ph＝10，40mm)，在紫外灯下观察结果；根据免疫层析试纸条上检测线的绿荧光强度，可以对样品中的目标物afp进行定性和半定量检测。实验结果(图4)表明，随着afp标准物质稀释液浓度的增加，检测线上的荧光强度上升。
68.上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求书的保护范围内。

技术特征：

1.一种绿荧光纳米球的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：s1.分别配制绿荧光金纳米簇auncs溶液、树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn溶液和聚醚酰亚胺pei溶液；s2.向dmsn溶液中加入pei溶液混合均匀并进行超声反应，即得表面包被有pei的dmsn混合溶液；s3.将步骤s2中得到的混合溶液离心分离并复溶后，加入auncs溶液混匀并进行超声反应，多次离心纯化，去除溶液中未结合的auncs，制得绿荧光纳米球dmsn@auncs。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，采用ph＝10的氢氧化钠水溶液配置auncs溶液、dmsn溶液和pei溶液，在避光条件下进行超声反应。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn的制备包括如下步骤：s11.将三乙醇tea添加到水中，搅拌加热，得到混合溶液；s12.将十六烷基三甲基氯化铵ctac和水杨酸钠加入上述混合溶液中，反应一段时间，逐滴加入硅酸四乙酯teos持续反应10-14h；s13.收集s12反应所得产物并用乙醇和水交替离心洗涤，最终制得所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括将最终制得所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dmsn分散在含盐酸的甲醇中，并在40-60℃下萃取。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1中所述绿荧光金纳米簇auncs溶液的制备包括如下步骤：s21.将溶解在naoh溶液中的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶att和氯金酸按一定的体积比混合，静置反应后得att@auncs溶液，采用纯水透析进行纯化；s22.将精氨酸arg溶液添加到纯化后的att@auncs溶液中，反应12-36小时，采用纯水透析进行纯化，制得绿荧光金纳米簇auncs溶液。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶att和氯金酸arg的体积比为1：1-1：3；氯金酸arg溶液和透析后的att@auncs溶液的体积比为1：8-1：10。7.一种绿荧光纳米球，其特征在于，所述绿荧光纳米球采用权利要求1-6任一项所述的制备方法获取。8.一种采用权利要求7所述的绿荧光纳米球作为检测探针的应用。9.根据权利要求8所述的绿荧光纳米球作为检测探针的应用，其特征在于，所述绿荧光纳米球用于基于抗原抗体特异性识别的荧光免疫层析方法中。10.根据权利要求9所述的绿荧光纳米球作为检测探针的应用，其特征在于，所述绿荧光纳米球用于基于抗原抗体特异性识别的荧光免疫层析方法中，包括如下步骤：(1).根据待层析的样品中的目标物，确定特异性抗体；(2).然后将特异性抗体与绿荧光纳米球偶联成为检测探针；(3).在样品中加入检测探针，孵育反应一段时间后得混合物；(4).将所述混合物滴加在免疫层析试纸静置层析反应一段时间，再在免疫层析试纸条的检测区域和质控区域滴加arg溶液，实现样品中目标物的检测。

技术总结

本发明涉及一种绿荧光纳米球、制备方法和用途，包括：分别配制绿荧光金纳米簇AuNCs、树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒DMSN和聚醚酰亚胺PEI的溶液；向DMSN溶液中加入PEI溶液混合均匀并进行超声反应，即得包被有PEI的DMSN溶液的混合溶液；将得到的混合溶液离心分离并复溶后加入AuNCs溶液混匀并进行超声反应，经多次离心纯化即得绿荧光纳米球DMSN@AuNCs。本发明操作简单、成本低廉、反应条件温和、绿环保，所制备得到的绿荧光纳米球DMSN@AuNCs可作为荧光标记材料用于免疫学检测领域；根据DMSN@AuNCs上标记的抗体和抗原的不同，可以形成多种荧光检测探针用于检测不同的目标物，在疾病标志物高通量检测等方面有着很高的推广应用价值。很高的推广应用价值。很高的推广应用价值。