一种含氮环氧类化合物及其制备方法和应用

1.本发明属于药学技术领域，具体涉及一种新型的含氮环氧类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

2.近年来，具有抗生素耐受性的微生物种类越来越多，在动物饲粮中不合理使用抗生素会导致细菌耐药性传播、畜牧类肉制品质量下降等。因此，开发新型的抗菌药物已成为医学、食品、饲料等领域亟待解决的问题。从中药、天然药物中获得具有抑菌作用的天然产物，是获取具有抑菌作用成分的一种新型渠道。
3.杜仲（eucommia ulmoides oliver）为杜仲科（eucommiaceae）杜仲属（eucommia）落叶乔木，是仅存于我国的第三纪孑遗植物，以珍稀濒危第二类的保护树种被列入《中国植物红皮书-稀有濒危植物》第一卷，单科单属单种，主要分布在四川、云南、贵州、湖北等地。其干燥树皮，叶为主要药用部位，录入药典。杜仲在我国的使用目前最早可追溯至汉朝。汉墓出土的医药木简有杜仲“七伤”的使用记录。《神农本草经》列药365味，分上中下三品，杜仲被列为上品滋补药，记：杜仲，性微甘、补中益气、微辛、坚筋骨、益腰膝、强志、除酸痛、久服有轻身耐劳之功效[1]。魏晋南北朝的《雷公炮制论》中，又详细的将杜仲的炮制工艺改进一番，去糙皮后炙炒以增其功。宋金元时期的《本草图经》，承前启后，对杜仲的研究和使用增补了许多新的内容。明清时期，《本草纲目》集历代医药之大成，对杜仲的使用也进行了一次全面的总结整理，影响至今。统观杜仲2000多年的应用历史，集中在医药、食用、保健三方面，经济价值无甚记载。统观近现代文献，杜仲的应用范围扩大至工业、农业、建材业等，商业价值大大提高，药用部位也由原来的皮扩大至叶，花，籽，医药资源进一步拓展，药理作用也随着研究的深入得到进一步完善，从单一的滋补肝肾，强筋骨增加了调节血压血脂，降血糖，抗氧化，润肠通便，增强免疫抗肿瘤，护肝醒酒等新功效。

技术实现要素：

[0004]
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种从杜仲上提取获得的新型含氮环氧类化合物。经试验发现：该含氮环氧类化合物可用于制备抗菌抑菌药物。
[0005]
本发明还提供了上述含氮环氧类化合物的制备方法和应用。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种含氮环氧类化合物，该化合物的结构式如下所示：
。
[0007]
一种上述含氮环氧类化合物的制备方法，其包括如下步骤：1）取粉碎过的杜仲小枝干粉，用90-95%乙醇在室温下浸提，再回流提取，浸提液经减压浓缩得到乙醇浸膏；2）将乙醇浸膏悬浮于水中，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，萃取液浓经缩得到乙酸乙酯浸膏；3）将乙酸乙酯浸膏用水溶解后，过硅胶谱柱，用体积比20:1－0:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，检测合并得到5个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e；4）将fr.a用甲醇溶解，硅胶拌样，经硅胶柱用体积比30:1－1:2的石油醚
–
丙酮梯度洗脱，检测合并得到7个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a1、fr.a2、fr.a3、fr.a4、fr.a5、fr.a6、fr.a7；5）fr.a1经反相c18柱用30－90%甲醇-水梯度洗脱，得到两个组分，按洗脱顺序，依次记为：fr.a1a、fr.a1b；6）将fr.a1a采用制备hplc（rp-c18），60%甲醇-水作流动相，在波长 210nm、流速 10ml/min的条件下纯化即得。
[0008]
具体的，步骤3）中，用体积比20:1、10:1、5:1、1:1、0:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。
[0009]
具体的，步骤4）中，用体积比30:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:2的石油醚
–
丙酮梯度洗脱。
[0010]
进一步的，步骤5）中，用30%、50%、70%、90%甲醇-水梯度洗脱。
[0011]
本发明提供了上述含氮环氧类化合物在制备抗菌抑菌药物方面的应用。
[0012]
进一步优选的，上述的应用，所述菌包括但不仅限于禾谷镰刀菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌等多种病原菌。
[0013]
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明化合物结构稳定，属于含氮环氧类化合物，且其提取原料是来自生长于中国境内的杜仲。杜仲广泛分布于我国南方地区，资源十分丰富。与以其它甾体化合物为原料制备油菜甾醇类植物化合物相比，本发明生产条件温和，实验步骤少，技术难度小，生产成本低，环境污染小；同时其原料丰富、属于天然可再生资源；提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，不会造成生态环境污染。本发明经试验发现：本发明含氮环氧类化合物对多种病原菌（如禾谷镰刀菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌等）表现出较好的细菌抑制活性，可用于制备抗菌、抑菌药物。
附图说明
[0014]
图 1 为本发明实施例1制备所得化合物1的hr-esi-ms谱；图 2 为本发明实施例1制备所得化合物1的1h nmr谱；图 3 为本发明实施例1制备所得化合物1的
13
c nmr谱；图 4 为本发明实施例1制备所得化合物1的hsqc谱；图 5 为本发明实施例1制备所得化合物1的hmbc谱；图 6 为本发明实施例1制备所得化合物1的noesy谱；图 7 为本发明实施例1制备所得化合物1的平面结构图。
具体实施方式
[0015]
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0016]
下述实施例中，如无特殊说明，所用原料均为可以直接购买到的普通市售产品。室温指代25
±
5℃。
[0017]
实施例1本发明化合物的提取原料为杜仲（eucommia ulmoides oliver），杜仲的小枝于 2018 年 10 月采自河南开封，由河南大学袁王俊教授鉴定，标本储存在河南大学药学院标本馆。
[0018]
一种含氮环氧类化合物，该化合物的结构式如下所示：。
[0019]
上述含氮环氧类化合物的制备方法，其包括如下步骤：1）取粉碎过的杜仲的小枝干粉10 kg，用95%乙醇（3
×
35l）在室温下浸泡24小时后，回流提取3次（每次3h），合并3次所得的浸提液并经减压浓缩得到乙醇浸膏；2）将步骤1）所得乙醇浸膏悬浮于1l水中，依次用5l二氯甲烷、5l乙酸乙酯萃取，萃取液浓经缩得到69g乙酸乙酯浸膏；3）将乙酸乙酯浸膏（69g）用500ml水溶解后，过硅胶谱柱，用体积比20:1、10:1、5:1、1:1、0:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，检测合并得到5个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e；4）将fr.a（15g）用15ml甲醇溶解，硅胶拌样，经硅胶柱用体积比30:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:2的石油醚
–
丙酮梯度洗脱，检测合并得到7个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a1、fr.a2、fr.a3、fr.a4、fr.a5、fr.a6、fr.a7；
5）fr.a1经反相c18柱用30%、50%、70%、90%甲醇-水梯度洗脱，得到两个组分，按洗脱顺序，依次记为：fr.a1a、fr.a2b；6）将a1a采用制备hplc（rp-c18），60%甲醇-水作流动相，在波长 210nm、流速 10ml/min 的条件下纯化，收集出峰时间为8.5min的化合物，即得含氮环氧类化合物（56mg，tr＝8.5min），记为化合物 1。
[0020]
下述给出了化合物1的相关试验数据（具体可见图1至6）。
[0021]
无透明油状物，易溶于甲醇，二氯甲烷。hr-ms: m/z 452.2775[m+na]
+
（calcd for 452.2879），430.2954[m+h]
+
（calcd for 430.2957），分子式为：c
26h39
no4。uv(meoh)显示在 294nm 处有明显的紫外吸收。ir(cm-1
)显示的信号有：2920，1740，1692，1456，1381，1270，1198，1121。[α]
−
68 (c = 0.075, 甲醇); ir (kbr) ν
max
: 3425, 2938, 1649, 1547, 1453, 1401, 611; esi-ms: 401.2 [m+ na]
+
; hr-esi-ms: 401.2678 ([m+ na]
+
, c
23h38o4 na; calcd 401.2662)。1h nmr和
13
c nmr数据参见表1。
[0022]
表1 化合物1的1h (400 mhz) 和
13
c (100 mhz) nmr 数据归属
化合物 1 结构解析。
[0023]
无透明油状物，易溶于甲醇，二氯甲烷。hr-ms: m/z 452.2775[m+na]
+
（calcd for 452.2879），430.2954[m+h]
+
（calcd for 430.2957），分子式为：c
26h39
no4。uv(meoh)显示在 294nm 处有明显的紫外吸收。ir(cm-1
)显示的信号有：2920，1740，1692，1456，1381，1270，1198，1121。旋光数据显示值为：-68
°
。1h-nmr (cd3od) 谱中可以看出7个甲基氢信号δ
0.88（6h，t，j = 7.4 hz ，ch
3-14，15），1.41（3h，s，ch
3-16），1.40（3h，s，ch
3-17），0.94（3h，s，j = 7.4 hz ，ch
3-7
′
），1.03（3h，s，j = 7.0 hz ，ch
3-8
′
），2.85（3h，s，ch
3-9
′
）；2个双键氢信号 δ5.41（1h，dt，j=10.3，1.7hz，h-9），5.68（1h，ddd，j=10.3，5.3，3.2hz，h-10）；3个亚甲基氢信号 δ1.61，0.83（2h，ddt ；t，j = 11.9，4.0，1.9；1.8 hz，h-5），1.38，0.83（2h，s；t，j = 1.5 hz，h-7），1.5（2h，d，j = 7.4，h-6
′
）； 10个烯烃基氢信号δ3.40（1h ，dd， j = 12.1，10.8 hz， h-2），2.48（1h ，dt，j = 12.1，4.5 hz，h-3），1.47（1h ，d，j = 7.7hz，h-4），1.80（1h ，ddd， j = 11.1，5.9，3.0hz， h-6），2.16（1h ，ddt，j =17.3，10.0，6.0 hz，h-8），2.60（1h ，dd，j = 10.9，2.7hz，h-11），4.02（1h ，m，h-13），3.58（1h ，d， j = 2.1 hz，h-4
′
），3.82（1h，s，h-1
′
），1.74（1h ，td，j = 7.1，2.1hz，h-5
′
）。
13
c-nmr (cd3od) 谱中可以看出低场区给出2个羰基碳信号 δ203.3（c-1），167.8（c-3
′
）；2个双键碳信号 δ123.0（c-9），132.6（c-10）。高场中给出7个甲基碳信号 δ24.9（c-14），22.5（c-15），23.9（c-16），14.7（c-17），13.2（c-7
′
），14.6（c-8
′
），29.1（c-9
′
）。3个亚甲基碳信号 δ38.0（c-5），39.1（c-7），27.7（c-6
′
）。10个烯烃碳信号 δ44.6（c-2），38.7（c-3），33.0（c-4），37.8（c-6），37.16（c-8），51.2（c-11），82.7（c-13），69.9（c-1
′
），108.8（c-2
′
），64.6（c-4
′
），34.8（c-5
′
），其中13位上的碳和1
′
位上的碳化学位移因为所连接的氧原子而向低场位移，4
′
位上的碳化学位移值因为所连接的n原子而变大，因为n原子的电负性比o原子的小，所以对所邻近的c原子的影响就相对较小。还有2个季碳的碳信号 δ86.4（c-12），108.8（c-2
′
）。2
′
位上的碳由于2个羰基氧和1个临近氧原子的影响，化学位移向低场移动幅度较大，化学位移值偏大。通过 hsqc 和 hmbc 谱确定了化合物1的平面构型，根据hsqc ，hmbc碳氢位置关系对碳、氢信号进行归属。从hmbc 谱中可以看出，母核中 δ0.88（h-14）与 38.7（c-3），38.0（c-5）远程相关，δ0.88（h-15）与38.0（c-5），39.1（c-7）远程相关，δ1.64；0.83（h-5）与 δ38.7（c-3），39.1（c-7）远程相关，推测 c-4，c-6上各连1个甲基，δ2.16（h-8）与 δ33.0（c-4），37.8（c-6）远程相关，综上推测c-3，4，5，6，7，8构成一个六元环。h-8与 δ132.6（c-10），44.6（c-2）远程相关，h-9与 δ51.2（c-11），44.6（c-2）远程相关，h-10与 δ51.2（c-11）远程相关，h-2与 δ38.7（c-3）远程相关，由此推出c-2，3，8，9，10，11构成一个六元环。h-2与c-3，c-8相关，h-9，h-10分别同δ39.1（c-7），37.8（c-6）远程相关，可推测出两个六元环以c-3，c-8为共用键相连。δ1.41（h-16）与 51.2（c-11），82.7（c-13），123.0（c-9）；1.40（h-17）与86.4（c-12）远程相关，推测 c-12，c-13上的1个h分别被ch
3-16和ch
3-17取代。 3.39（h-2）与 δ203.3（c-1），86.4（c-12），69.6（c-1
′
）远程相关，2.61（h-11）与 δ203.3（c-1），82.7（c-13）远程相关，3.82（h-1
′
）与 δ203.3（c-1）远程相关，推测c-1，2，11，12，13，1
′
，2
′
构成一个含氧的八元环以c-2，c-8为共用碳原子同六元环相连。δ2.87（h-9
′
）与 167.77（c-3
′
），64.6（c-4
′
）远程相关，推测n原子上有一个甲基取代，且n原子同c-3
′
， c-4
′
相连，3.57（h-4
′
）与δ108.8（c-2
′
）远程相关，推测c-1
′
，2
′
，3
′
，4
′
，构成一个含n的五元杂环。δ1.03(h-8
′
)与64.6（c-4
′
），27.7（c-6
′
）远程相关，1.74（h-5
′
）与64.6（c-4
′
），27.7（c-6
′
），13.2（c-7
′
）远程相关，所以推测 c-5
′ꢀ
被甲基取代。通过查阅文献，发现化合物1的碳谱和氢谱数据与文献化合物对比，推测该化合物与spylidone的结构相似，从质谱上看，该化合物与spylidone 一致，都在429出峰，这进一步印证了化合物1与spylidone结构相似的猜测。根据上述各种核磁数据并且参照有关spylidone结构分析的文献，发现文献中3
′
位的碳δ208.5对应核磁数据中的64.9，2
′
位的碳δ72.5对应核磁数据中的108.8，两个位置的化学位移值变化都很大，其余碳氢化学位移
值与文献记载基本一致。基于核磁数据对比的异同，在文献化合物spylidone结构基础上，将含氮五元环的3
′
位开环，与13位的碳连接，12位的羟基内酯化与五元杂环2
′
位相连，得出化合物1的平面结构图（如图7所示），将此图在chemdraw中进行核磁数据模拟，与实测核磁数据一致，最后，在scifinder数据库查询已经推测出的化合物1的结构，结果显示无相关，所以推测化合物1为新化合物。平面结构确定完之后，再根据noe确定该化合物的相对构型：据文献记载母核六元环中14-ch3，15-ch3化学键朝外，为β构型，以此为参照，对照化合物1的noe谱图，发现2位上的氢，7位上的亚甲基中位移值为δ1.38的氢，12位上的甲基，13位上的氢，4
′
位上的氢，8
′
位上的甲基，9
′
位上的甲基均为β构型；3位上的氢，4位上的氢，7位上位移值为δ0.81的氢，13位上的甲基，1
′
位上的氢，5
′
位上的氢均为α构型。
[0024]
化合物1的抑菌活性实验2.1 实验仪器、材料及动物g154tw高压灭菌器（厦门，致徽）；biotech-5bg发酵罐（上海，保兴）；zwy-211c恒温培养振荡器（上海，智诚）；sb-5200dtdn超声波清洗机（宁波，新知）；铁架台若干，分液漏斗（1000 ml）；锥形瓶（2000 ml）；r-1001vn旋转蒸发仪，dlsb-5/20低温冷却液循环泵；各种型号的玻璃层析柱若干；ms105电子天平（上海，梅特勒-托利多）；jr系列高精度数显恒温加热台（深圳），金黄葡萄球菌staphylococcus aureus，大肠杆菌escherichia coli，蜡样芽孢杆菌bacillus cereus，枯草芽孢杆菌bacillus subtili，禾谷镰刀菌fusarium graminearum等菌种均由河南大学药学院中药学袁王俊副教授鉴定，中药研究所保存。
[0025]
2.2 实验方法：纸片琼脂扩散法进行抑菌实验1）用打孔器以滤纸为原料打出直径为5 mm的圆形滤纸片即为药敏纸片；2）化合物1经甲醇溶解，所配成的溶液浓度为6.7 mg/ml；3）超净台紫外灭菌20 min后开1级风，将各分装灭菌后的pdb液体培养基用记号笔标记，然后用接种针分别将大肠杆菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、禾谷镰刀菌接种于各标记后的液体培养基。将培养基置于恒温摇床内设置程序为 28℃培养24小时；4）高温灭菌过的培养皿、药敏纸片、移液头、镊子、酒精灯，置于超净台上，紫外灭菌20min。pda固体培养基电炉上加热融化混匀。将培养皿分组，分为禾谷镰刀菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌5组。将步骤3）培养好的菌液，稀释100倍，无菌蒸馏水作为稀释剂，涡旋混匀，备用。分别吸取各菌液100 ul打入相应组别的培养皿内。将融化后的固体培养基在冷却至将凝未凝的状态时，倒入加了菌液的培养皿内，前后左右晃动使菌液与培养基充分混匀，控制培养基厚度为2-3 mm。在筛选具有抑菌活性的化合物时，待培养基凝固后在培养基底部用记号笔按等边三角形的角度做三个记号用于标记各药品；在测定具有抑菌活性的化合物的最小抑菌浓度时，需在培养皿底部标记好浓度。镊子在酒精灯上灼烧灭菌后夹取一个纸片，用最大量程为20 ul的移液调整量程为10 ul吸取药液10ul打在纸片上，纸片在吹风机下吹干后按培养皿底部记号放入相应培养皿内。全部药液打完后，用封口膜将培养皿封好放入28℃的恒温箱内，12小时后观察抑菌结果并做记录；5）将化合物的稀释浓度定为：2.880 mg/ml，1.725 mg/ml，1.440 mg/ml，0.863 mg/ml，0.431mg/ml，0.216 mg/ml，进行mic值测定。
[0026]
实验结果如表2所示。
[0027]
表2. 化合物的抑菌活性的mic值测定（mg/ml）由表2可以看出：本发明化合物1对5种供试菌禾谷镰刀菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌等均有一定的抑制作用，但就其自身作用来看，对大肠杆菌的抑制作用较其他4种菌要好，因此可用于制备抗菌、抑菌药物。

技术特征：

1.一种含氮环氧类化合物，其特征在于，该化合物的结构式如下所示：。2.权利要求1所述含氮环氧类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）取粉碎过的杜仲枝干粉，用90-95%乙醇在室温下浸提，再回流提取，浸提液经减压浓缩得到乙醇浸膏；2）将乙醇浸膏悬浮于水中，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，萃取液浓经缩得到乙酸乙酯浸膏；3）将乙酸乙酯浸膏用水溶解后，过硅胶谱柱，用体积比20:1－0:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，检测合并得到5个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e；4）将fr.a用甲醇溶解，硅胶拌样，经硅胶柱用体积比30:1－1:2的石油醚
–
丙酮梯度洗脱，检测合并得到7个组分，tlc按洗脱顺序，依次记为：fr.a1、fr.a2、fr.a3、fr.a4、fr.a5、fr.a6、fr.a7；5）fr.a1经反相c18柱用30－90%甲醇-水梯度洗脱，得到两个组分，按洗脱顺序，依次记为：fr.a1a、fr.a1b；6）将fr.a1a采用制备hplc，60%甲醇-水作流动相，在波长 210nm的条件下纯化即得。3.权利要求1所述含氮环氧类化合物的制备方法，其特征在于，步骤3）中，用体积比20:1、10:1、5:1、1:1、0:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。4.权利要求1所述含氮环氧类化合物的制备方法，其特征在于，步骤4）中，用体积比30:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:2的石油醚
–
丙酮梯度洗脱。5.权利要求1所述含氮环氧类化合物的制备方法，其特征在于，步骤5）中，用30%、50%、70%、90%甲醇-水梯度洗脱。6.权利要求1所述含氮环氧类化合物在制备抗菌抑菌药物方面的应用。7.如权利要求6所述含氮环氧类化合物在制备抗菌抑菌药物方面的应用，其特征在于，所述菌包括禾谷镰刀菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌。