井冈山大学学报(自然科学版)
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文章编号：1674-8085(2021)01-0026-04
*戴一，白娟，陶阿丽，施福瑞
（安徽新华学院药学院，安徽，合肥230088）
摘要：以二为起始原料通过制备酰氯后与姜黄素反应制得姜黄素-二偶联物。采用噻唑兰（MTT）法考察其对HeLa、HepG2、A2780及A549等4种肿瘤细胞的增殖抑制活性，通过线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测其对线粒体膜电位的破坏，通过流式细胞术检测其诱导的细胞凋亡。结果发现姜黄素-二偶联物抗肿瘤活性比单纯的姜黄素、二及姜黄素与二的混合物更强，且能更强地破坏线粒体膜电位及诱导细胞凋亡。可见姜黄素-二偶联物表现出显著的协同效应，具有潜在的药物开发价值。 关键词：姜黄素；二；偶联物；抗肿瘤活性
中图分类号：R284.3 文献标识码：A DOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2021.01.005
SYNTHESIS AND ANTI-TUMOR ACTIVITY OF CONJUGATE OF
CURCUMIN AND DICHLOROACETIC ACID
* DAI Yi, BAI Juan, TAO A-li, SHI Fu-rui
（Pharmacology College, Anhui Xinhua University, Hefei, Anhui 230088, China）
Abstract: Using dichloroacetic acid as starting material to prepare dichloroacetyl chloride, conjugate of curcumin and dichloroacetic acid was synthesized through reaction between curcumin and dichloroacetyl chloride. The in vitro antitumor activities of the conjugate was evaluated for HeLa, HepG2, A2780 and A 549 by MTT. Damage of mitochondrial membrane potential was measured by mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 and apoptosis of cells were assayed by flow cytometry methods. The results showed that the antitumor activity of conjugate of curcumin and dichloroacetic acid was more potent than those of curcumin, dichloroacetic acid or mixture of curcumin and dichloroacetic acid, moreover, it can destruct mitochondrial membrane potential and induce apoptosis of cells, more strongly. It is evident that conjugate of curcumin and dichloroacetic acid has significant synergistic effects, with a potential value of drug development.
Key words: curcumin; dichloroacetic acid; conjugate; anti-tumor activity
姜黄粉为一味古老的植物药，由草药姜黄的根茎制成。在印度传统医学及中医中均记载着姜黄粉可以用来预防和多种疾病，而其发挥药理作用的重要物质基础为姜黄素。姜黄素为一橙黄的多酚天然成分，除了在姜黄（Curcuma longa Linn）中含有外，在莪术（Curcuma zedoaria (Christm.) Rosc）和郁金（Curcuma aromatica Salisb）等植物中也有分布[1]。姜黄素药理活性多样，如抗炎、抗氧化、抗感染、肝脏保护、心脏保护及抗肿瘤作用，其抗肿瘤活性及机制是研究的热点[2-6]。姜黄素可以通过
第42卷第1期V ol.42 No.1 井冈山大学学报(自然科学版)
2021年1月Jan. 2021 Journal of Jinggangshan University (Natural Science) 26
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收稿日期：2020-10-12；修改日期：2020-11-22
基金项目：安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2019A0873，KJ2019A0874)；安徽新华学院制药工程教学团队建设项目（2017jxtdx08）
作者简介：*戴一(1979-)，男，安徽利辛人，副教授，博士，主要从事活性天然产物研究(E-mail:***************);
脱墨纸白娟(1987-)，女，山东潍坊人，讲师，硕士，主要从事制药工艺研究(E-mail:******************);
陶阿丽(1983-)，女，安徽合肥人，教授，硕士，主要从事有机合成化学研究(E-mail:*****************);
施福瑞(1999-)，女，安徽六安人，安徽新华学院药学院药学专业2016级本科生(E-mail:****************).
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多个靶点达到抗肿瘤的目的，如作用NF-κB 、AP-1、STAT3、EGFR 、P53、MMP-9等抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡及阻滞肿瘤转移等[7-8]。
二是一白液体，靶向线粒体抑制丙酮酸脱氢酶激酶（PDK ），干扰了肿瘤赖以生存的无氧糖酵解供能途径，导致细胞素c 的释放及凋亡诱导因子（AIF ）向细胞核的转移，进而引起细胞凋亡[9-10] 。单独使用二时活性并不强，多药联合是抗肿瘤的有效方法[11]。基于此，本实验设计合
成了姜黄素-二偶联物，并初步研究了该偶联物的抗肿瘤活性，对线粒体膜电位的破坏及细胞凋亡诱导，以期实现二与姜黄素协同作用，提高姜黄素的抗肿瘤活性，为新型姜黄素衍生物的研究开发提供参考。
1 仪器与试剂
BruckerACF-300型核磁共振仪，布鲁克（北京）科技有限公司；CytoFLEX 流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司；奥林巴斯IX71荧光显微镜，日本奥林巴斯公司；API3000质谱仪，美国PE 公司；bio-rad mode680酶标仪，美国伯乐生命医学产品有限公司；姜黄素(纯度大约98%)，购于大连美仑生物技术有限公司。DEME 培养基购于hyclone 公司，胎牛血清FBS 购于lonsera 公司，MTT 、JC-1试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒均购置于碧云天试剂公司，其他试剂均为分析纯。受试细胞株人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌细胞HeLa 细胞、人卵巢癌A2780细胞及人肺癌A549细胞来自于美国ATCC 公司。
2 目标化合物的合成
以二为起始原料，草酰氯作为酰化试剂
合成二氯乙酰氯，所得酰氯在缚酸剂三乙胺存在的条件下与姜黄素发生酯化反应即合成出姜黄素-二偶联物，见图1。产物经NMR 、MS 、IR 确认结构。
图1 姜黄素-二偶联物的合成
Fig. 1 Synthesis of conjugate of curcumin and dichloroacetic acid
2.1 二氯乙酰氯的制备[12]
取二（2 mL ，24 mmol ）置于250 mL 圆底烧瓶中，加CH 2Cl 2 100 mL 溶解，缓慢加入草酰氯(10 mL,120 mmol)及2滴N,N-二甲基甲酰胺（DMF ），室温搅拌反应4 h ，蒸馏收集108℃左右馏分得无液体即为二氯乙酰氯，收率74%。 2.2 姜黄素-二偶联物的合成
取姜黄素（228 mg ，1 mmol ），溶于50 mL 二氯甲烷中，加入三乙胺(277 μL ，2 mmol)，冰水浴条件下缓慢滴加二氯乙酰氯（324 mg, 2.2 mmol ）；滴加完毕，室温搅拌反应，TLC 跟踪；反应完毕，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得黄固体，收率为62%。TLC 分析R f 约0.5（展开剂为石油醚：乙酸乙酯=2：1）；1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 3.89(s, 6H), 5.88 (s, 1H), 6.21 (s, 2H), 6.59 (d, J = 15.8 Hz, 2H), 7.18 (m, 7H), 7.63 (d,
J = 15.8 Hz, 2H)；13
C NMR (101 MHz, Chloroform-d ) δ
56.10 , 63.86, 77.23, 102.02, 111.76, 120.96, 122.53, 124.82, 134.92, 139.65, 140.35, 151.10, 162.35, 182.99;
IR(KBr)ʋmax 3524, 3018, 2943, 2845, 1769, 1637, 1600, 1505, 1460, 1416, 1304, 1262, 1200, 1159, 1030, 968, 849, 815, 752 cm -1; m/z(ESI-MS) 591.0[M+H]+, 589.2[M-H]-。
3 结果与分析
3.1 体外抗肿瘤活性研究
于96孔板中接种对数生长期肿瘤细胞培养，每孔加 5000个细胞 培养基为100 μL ，于37℃，5%CO 2的全湿条件下培养，培养过夜后给不同浓度的待测化合物，平行3个孔，阴性对照组加给药组等体积的培养基，以DEME 培养基作为空白对照组，给药后继续培养48 h ，弃去培养液，每孔加5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL ，继续孵育4 h ，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL ，震荡10 min ，酶标仪490 nm 测定吸光度OD 值，计算抑制率及IC 50值。抑制率(%)=[1-(A
实验组
-A
空白组
发电机测试系统)/(A
对照组
-A
空白组
)]
´100%。对姜黄素、二、姜黄素与二1:2摩尔比混合物及姜黄素-二偶联物进行MTT 抗癌活性实验，结果见表1。姜黄素与二混合物活性明显高于姜黄素，体现了姜黄素与二之间具有协同效应，且姜黄素-二偶联物的活性又高于姜黄素与二的混合物，尤其
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对A549细胞、A2780细胞及HepG2细胞，姜黄素-二偶联物均表现出较强的肿瘤抑制活性，IC
50值分别为(12.42 ± 2.16) μM 、(16.69 ± 7.17) μM 和(12.44 ± 1.10) μM ，相比于母体化合物姜黄素(IC 50值分别为(18.84 ± 3.12) μM 、(23.83 ± 4.36) μM 和(28.35 ± 4.8 μM)活性提高了1倍左右，姜黄素与二进行偶联，具有较强的协同效果，为姜黄素新型衍生物的开发提供了依据。
表1 姜黄素-二偶联物体外抗肿瘤活性结果 Table 1 In vitro antitumor activities of conjugate of
curcumin and dichloroacetic acid
IC 50(μ M)
化合物 HepG2
HeLa
A2780 A549 姜黄素
28.35 ± 4.80 15.97 ± 3.71
23.83 ± 4.36
18.84 ± 3.12
姜黄素与二氯乙
酸混合物(1:2) 27.31 ± 3.98 10.09 ± 1.89 28.06 ± 12.61 17.64 ± 2.89
姜黄素与二氯乙
酸偶联物 12.44 ± 1.10 13.62 ± 2.02 16.69 ± 7.17 12.42 ± 2.16
二 ＞400 ＞400 ＞400 ＞400
3.2 姜黄素-二偶联物对线粒体膜电位的破坏
基于线粒体途径的细胞凋亡早期可看到线粒体膜电位的破坏，通过JC-1荧光探针测定红绿荧光
的相对比率可研究线粒体去极化的比例。于6孔板中接种HepG2 细胞，每孔10万个细胞，2 mL 完全培养基在37℃、5%CO 2培养箱培养过夜，于次日分别用含药培养基进行替换继续培养24 h ，所加药物的浓度姜黄素-二偶联物、姜黄素、姜黄素与二混合物（摩尔比1:2）以姜黄素计均为100 μM ，二为200 μM 。24 h 后按线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)（购于碧云天生物）原位处理，经PBS 洗涤后用荧光显微镜观察。单独二在考察时间内对线粒体几乎没有影响，与对照组一样染后以红荧光主导，几乎看不到绿。对于单独的姜黄素组，可见到明显的绿，单独的姜
黄素对细胞线粒体电势产生了破坏作用，但其红绿荧光的比率明显大于姜黄素与二混合物组，说明姜黄素与二具有协同作用，更强地破坏线粒体膜电位，但其强度仍略低与姜黄素-二偶联物，可能是姜黄素-二偶联物具有更高的脂溶性，细胞摄取更高而产生了更强的作用。因此，姜黄素-二偶联物具有更高的生物活性。
(A：对照；B：二；C：姜黄素；D：姜黄素与二混合物；E：姜黄素-二偶联物）
图2 姜黄素-二偶联物对线粒体膜电位的破坏
Fig. 2 Damage of conjugate of curcumin and dichloroacetic acid to mitochondrial membrane potential
3.3 姜黄素与二偶联物诱导细胞凋亡
于12孔板中接种HepG2 细胞，每孔20万个细胞，1 mL 完全培养基在37℃、5%CO 2培养箱培养过夜，
于次日分别用含药培养基进行替换继续培养48 h ，所加药物的浓度姜黄素-二偶联物、姜黄素、姜黄素与二混合物（摩尔比1:2）以姜黄素计均为50 μM ，二的为100 μM 。48 h 后按Annexin V-FITC 凋亡试剂盒说明书（购于碧云天生物）收集所有细胞，经PBS 洗涤后加Annexin V-FITC 及PI 进行染，流式细胞仪检测。 结果可见，相比于对照组，单独的二诱导的细胞凋亡略高，而单独姜黄素组诱导的凋亡提高了1.03倍，姜黄素与二混合物则提高了1.88倍，姜黄素-二偶联物提高了3.15倍，可见姜黄素与二具有协同作用，且偶联组合效果更好，与MTT 结果基本一致。
(A ：对照4.94；B ：二7.11；C ：姜黄素10.04；D ：姜黄素与二混合物14.2；E ：姜黄素-二偶联物20.5）
图3 姜黄素-二偶联物诱导凋亡
Fig. 3 Effect of conjugate of curcumin and dichloroacetic acid on the apoptosis dichloroacetic acid
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4 小结
姜黄素作为一个酚类天然产物，受到广泛地关注，尤其在抗肿瘤领域研究较为活跃。在对抗肿瘤的研究中，姜黄素采用了多种形式，如纳米药物运输、结构改造、多药联用等[13-14]；本实验采用酯化反应，通过姜黄素的羟基与二成酯制成前药，二可以干扰线粒体代谢途径达到抗肿瘤目的。该合成的前药姜黄素-二偶联物在细胞内酯酶作用下释放出姜黄素与二，起到协同抗肿瘤效果。通过MTT实验可见，对4种肿瘤细胞A549、HepG2、A2780及HeLa均表现出较强的肿瘤抑制活性，相比于母体化合物肿瘤抑制活性有了明显的提高，在线粒体膜电位及凋亡诱导研究中，表现出的结果与MTT结果一致，偶联物均较母体化合物姜黄素有了显著的提高，体现了姜黄素与二之间的协同效应，说明姜黄素与二的偶联组合对于更高活性姜黄素衍生物开发是一个有效选择。无叶风扇控制器
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