种植牙因其稳固牢靠功能持久，已成为替代缺失牙不可或缺的方法。在考虑到合适的适应证、缺牙区解剖及个体因素，种植体植入似乎是一种安全的选择[1]。种植体周围炎与天然牙牙周炎症状类似[2-4]。植入物受者发生严重并发症的风险很高，包括感染、无菌性松动、移位和断裂，其中，种植体相关感染的发生率仍然很高。迫切需要制定有效的策略来降低植入物相关感染的风险及其潜在的危及生命的并发症[5]。
酚类和多酚类广泛分布于植物组织中，具有丰富而复杂的物理和化学性质光谱，具有广泛的化学通用性，包括吸收紫外线辐射、清除自由基和金属离子络合作用[6]。我们可以利用植物多酚及其类似物的多功能性以及低成本性来形成无多功能涂层的生物启发 ·基础研究·
钛表面单宁酸络合氯化钙涂层接枝氯己定功能及稳定性探究 袁红春，李向阳，王银龙
（安徽医科大学口腔医学院 安徽医科大学附属口腔医院 口腔疾病研究安徽省重点实验室，安徽 合肥,230032）
【摘 要】目的 探究钛表面单宁酸和氯化钙络合后接枝氯己定的生物相容性、抗菌性以及稳定性。以期在 种植体表面构建持久抗菌涂层。方法 商业钛片经打磨后，以光滑钛片为对照组，接枝不同浓度的氯己定。通过X射线光电子能谱分析元素组成。接触角测量仪分析其亲水性，Zeta电位实验分析其反应稳定性，金黄葡萄球菌的涂板计数法，抑菌环法以及增值法分析其抗菌性能。甲基噻唑基四唑法和荧光显微镜观察细胞培养1d，3d的细胞活性，以及浸泡1、4、7、14、30、60d后测量涂层的稳定性。结果 单宁酸和钙络合后钛表面 C 、Ca原子百分含量明显增加，接触角下降，zeta电位数值下降；接枝氯己定后，接触角上升，菌液涂板未见菌落，抑菌环透亮，细菌增值OD为0.06 ；细胞培养1、3 d氯己定组细胞活性与对照组无显著性差异（P>0.05），氯己定组钛表面黏附大量细胞，且细胞形态良好。浸泡1、4、7、14、30、60天后抑菌环，细菌涂板法以及增值法分析其有良好的抗菌性。结论钛表面单宁酸和氯化钙络合后接枝氯己定有良好的生物相容性和优良的抗菌抑菌能力，且具有持久的稳定性。 【关键词】 单宁酸；钙；氯己定；稳定性
DOI：10.19593/j.issn.2095-0721.2021.03.024
Study on the Function and Stability of Grafting Chlorhexidine onto Tannic Acid Complexing Calcium Chloride Coating on Titanium Surface
YUAN Hong-chun, LI Xiang-yang, WANG Yin-long
(College & Hospital of Stomatology,Anhui Medical University,Key Lab. of Oral Diseases Research of Auhui Province, Auhui Province, 230032,China)
[ABSTRACT]Objective To investigate the biocompatibility, antibacterial activity and stability of the grafted chlorhexidine after complexation of tannic acid and calcium chloride on titanium surface.To construct long-lasting antibacterial coating on implant surface. Methods Commercial titanium plate after grinding, smooth titanium plate as control group, grafted with different concentrations of chlorhexidine.The composition of the elements was analyzed by X-ray photoelectron spectroscopy.The hydrophilicity was analyzed by contact Angle measuring instrument, the reaction stability was analyzed by Zeta potential test, and the antibacterial properties were analyzed by staphylococcus aureus smear counting method, bacteriostatic ring method and increment method.Methylthiazolyl tetrazolium method and fluorescence microscope were used to observe the cell activity of 1d and 3d culture, and the stability of the coating was measured after soaking for 1, 4, 7, 14, 30 and 60 days.Results After the complexation of tannic acid and calcium, the content of C and Ca atoms on the titanium surface increased obviously, the contact Angle decreased, and the Zeta value decreased and became stable. After the grafting of chlorhexidine, the contact Angle increased, no colonies were found on the bacterial liquid coating plate, the inhibition ring was transp
arent, and the bacterial proliferation OD was 0.06.There was no significant difference in cell activity between the chlorhexidine group and the control group at 1 and 3 days of cell culture (P>0.05), a large number of cells were attached to the surface of titanium in chlorhexidine group, and the cell morphology was good.After soaking for 1, 4, 7, 14, 30, 60 days, the antibacterial ring, bacterial coating method and increment method were used to analyze the antibacterial activity of the product. Conclusions The grafting of chlorhexidine onto tannic acid and calcium chloride on titanium surface has good biocompatibility and excellent antibacterial and bacteriostatic ability, and has lasting stability.
[KEY WORDS] tannin;calcium;chlorhexidine;stability
第一作者：袁红春，硕士研究生；E-mail:****************
通信作者：王银龙，教授、主任医师、硕士生导师；研究方向：口
腔颌面外科；E-mail:*****************
方法。
以天然多酚为有机配体，金属离子为无机交联剂在一系列基底上来制备各种薄膜。在环境温度下，多
酚和金属离子在水中混合后形成超分子网格结构从而会发生薄膜沉积[7]。近年来，基于酚类分子(即三酚和邻苯二酚的组成基团)的普遍粘附特性，金属酚醛网络(mpn)已成为一种用途广泛的表面改性剂。这种金属酚胺网络结构可以通过酚类的强黏附力，将结合金属离子的涂层黏附到许多表面，赋予表面该金属离子和多酚的双重功能。这种结构目前已经被应用到石墨烯，纳米金刚石，牙甚至细胞膜的表面改性中[9.9]
。
氯己定广泛应用于牙科的杀菌抑菌材料。具有低毒性，对细菌、真菌、藻类和病毒也有有效的抑制作用。氯己定的主要结构包括两个对称的4-氯苯基环和两个结合在六亚甲基中心链上的双胍单元，可与酚类的酚羟基发生反应[10]。因此，我们可以将单宁酸和钙离子组成超分子网络结构，同时接枝氯己定黏附在牙种植体表面。
本项研究拟在钛表面通过单宁酸和氯化钙的络合，共价接枝氯己定，构建接枝氯己定的钛表面，并评价其抗菌能力、生物相容性及稳定性的能力。
热镀锌线槽1 材料与方法1.1材 料
纯钛（山西宝鸡有金属有限公司），单宁酸、氯化钙（美国Sigma Aldrich 公司）；丙酮、Tris （
上海阿拉丁试剂有限公司），脑心浸液肉汤(Brain Heaet Infusion Broth ， BHI ) （青岛高科园海博生物技术有限公司），小鼠成骨样细胞系（MC3T3‐E1）细胞（中国科学院上海细胞库），金黄葡萄球菌（上海保藏生物技术中心），胎牛血清（Gibco ，新西兰），醋酸氯己定（chlorhexidine acetate ，CHX ）、罗丹明 123（Sigma‐Aldrich ，美国），X射线光电子能谱（X‐ray photoelectron spectroscopy ，XPS ）（Thermo ，美国），接触角测量仪（承德市成惠试验机有限公司），酶标仪（BioTek ，美国），培养箱（Thermo ，美国），超净工作台（苏州净化设备有限公司）。1.2 钛片表面预处理
商业纯钛切割成直径10 mm的圆形钛片，经320、
图1 单宁酸络合氯化钙后接枝氯己定的反应示意图
400、600、800、1000、2000目金刚砂纸打磨光滑，依次放入盛有丙酮、无水乙醇、去离子水的玻璃器皿中，超声清洗三次，每次约5到6分钟，取出样品，在恒温干燥箱中干燥备用。
1.3 单宁酸@钙离子接枝氯己定涂层的制备
制备步骤如图1所示，用溶质为1.21mg/ml的Tris 溶液，配置单宁酸浓度为0.8mg/ml和氯化钙1.6mg/ml 浓度的溶液，将预处理过的钛片样品放入24孔钛板中，分别加入单宁酸和氯化钙500uL，充分混匀，溶液温度20℃，浸泡24h；取出钛片样品，去离子水冲洗，超声震荡两次，每次3到5分钟，吹干。
将吹干后的样品转移到新的24孔板中，配置水溶液浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg/ml氯己定溶液，每孔加入1ml，溶液温度20℃，浸泡24h；取出钛片样品，去离子水冲洗，超声震荡两次，每次3到5分钟，吹干。1.4 表面成分表征
x射线光电子能谱（XPS）对样品表面元素进行定性分析，证明涂层的成功构建；1.5表面润湿性
采用接触角测量仪分析样品表面的润湿性。将去离子水装入针筒中，滴入到待测钛片表面，测量水接触角。
1.6溶液Zeta 电位测量
将立即制备和反应24小时后的单宁酸和钙离子反应液测量Zeta电位。1.7抗菌性能评价
选用种植体周围炎常见细菌金黄葡萄球菌， 将 108 CFU/L菌液80 μl接种于钛片样品表面上培养4 h，
加入2ml的培养基，继续培养 24 h。①每组3个样品，分别稀释1000倍后取80ul菌液均匀涂布至琼脂板上，培养8h后观察并计数平板表面菌落数。②每组取3个样品，分别吸取150ul 溶液用酶标仪在波长为 660 nm下测量吸光度，通过浊度法评价材料抗菌能力;③每组3个样品，分别取80ul菌液均匀涂布至琼脂板上，将灭菌好的样品正面与琼脂培养基接触，放置在琼脂板上。培养8小时后观察细菌生长情况和抑菌环。 1.8生物相容性评价
取小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1 细胞培养、换液、传代后调整细胞至适宜浓度接种于24已灭菌钛片
图5 生物相容性评价
图6 稳定性抗菌评价结果
组水接触角分别为62.96±1.27、61.35±0.25、
61.96±4.50、59.96±2.72、58.07±1.35、
64.87±1.38，由于氯己定带正电荷，表现出较强疏
水性，使得水接触角较空白和未接枝组明显增高
2.3溶液Zeta电位测量
随着钙离子浓度的增加Zeta电位数值呈现减小的
趋势。同时相较于反应前，24小时的Zeta电位几乎都
组培养基浑浊，接枝氯己定组的培养基均澄清（图
4A）。抑菌环实验结果显示对照组与未接枝氯己
定组未见抑菌环而接枝氯己定组见明显的抑菌环
（图4B）。细菌涂板实验显示对照组与未接枝氯己
定组可见琼脂平板有金黄葡萄球菌生长，接枝氯
己定无菌落的出现（图4C）。同时分别吸取培养基
检测OD值结果空白吸光度值0.415±0.025，未接枝
氯己定组吸光度值0.434±0.089，接枝不同浓度氯
己定（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2）组吸光度值
弹力玩具分别为0.060±0.008、0.056±0.001、0.055±0.004、
0.054±0.001、0.055±0.002、0.056±0.001（图4D）。
在空白钛片表面和单宁酸络合钙的钛表面可见细菌增
值，在经过氯己定的接枝后，呈现了抗菌性，说明钛
片通过单宁酸与钙的络合与氯己定发生反应而结合，
形成具有抗菌表面的涂层。
2.5生物相容性评价
培养1天和3天后，通过MTT法检测不同表面的
成骨细胞增殖情况。一天MTT结果（图5A）空白
吸光度值0.304±0.009，未接枝氯己定组吸光度值在减小，整个体系在钙离子浓度低时较稳定，反应前
较反应后稳定。
施梦月2.4抗菌评价
细菌稀释培养24小时后对照组与未接枝氯己定
0.300±0.016，接枝不同浓度氯己定（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2）组吸光度值分别为0.329±0.009、0.290±0.027、0.309±0.033、0.292±0.022、0.316±0.017、0.300±0.009（P＞0.05）。三天MTT 结果（图5B）空白吸光度值0.425±0.038，未接枝氯己定组吸光度值0.397±0.017，接枝不同浓度氯己定（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2）组吸光度值分别为0.366±0.019、0.315±0.019、0.371±0.011、0.342±0.010、0.353±0.032、0.348±0.006（P＞0.05）。
一天荧光显微镜观察细胞增值结果结果（图5C）与三天荧光显微镜观察细胞增值结果（图5D）显示细胞的数目以及形态良好与对照组无明显差异。
2.6稳定性实验
抑菌环实验(图6A)空白组无抑菌环，涂层PBS 浸泡1、4、7、14、30、60天可见抑菌环。涂板计数实验（图6B）空白组菌落数平均值144，涂层PBS浸泡1、4、7、14、30、60天均未见菌落。细菌增值实验（图6C）空白吸光度值0.280±0.005，涂层PBS浸泡1、4、7、14、30、60天吸光度值0.068±0.001、0.063±0.001、0.062±0.001、0.063±0.001、0.062±0.001、0.063±0.001。浸泡后的涂层仍具有良好的抗菌性，说明接枝的氯己定仍结合在钛片表面发挥抗菌作用。
3 讨 论
钛及其合金由于具有良好的生物相容性和力学性能，是牙科和生物医学种植中最常用的材料[11]。但其无抗菌能力，所以对种植体周围炎很难防治。一般来说，细菌感染有几个阶段。最初接触病原体和细菌粘附是感染的最早步骤。一旦细菌牢固地粘附在表面上，它们就开始增殖[12]，导致生物膜的形成。生物膜成熟后，细菌可从生物膜边缘扩散，侵入周围组织[13]。假体周围组织的细胞内侵袭和骨退化是感染晚期常见的并发症，是的难点[14]。考虑到的困难和种植失败的严重后果，确保足够的预防措施到位，并能从感染的早期阶段采取行动是至关重要的。在各种细菌中，金黄葡萄球
亮晶晶眼贴菌约占50%的侵袭性术后感染[15-16]。
书立
通过对种植体表面黏附多酚和钙离子再接枝氯己定来达到抗菌目的。通过细菌增值，抑菌环和涂板实验说明了接枝氯成功接枝到钛表面。通过浸泡1，4，7，14，30，60d后稳定性实验说明氯己定能持久释放。CHX 由于具有广谱抗菌性和不诱发细菌耐药性的优点[17]，已用于抗菌洗液或被制成缓释药物[18,19] 。
酚类和多酚类广泛分布于植物组织中，具有很强的抗氧化作用，具有潜在促进健康作用的化合物。与多种生物功能有关，如化学防御、素沉着、结构支撑、辐射防护等，此外，食用富含植物多酚的食品和饮料据称对健康有益[20]。最近，我们报道了一种快速、低成本的方法用于不同基材的共形涂层，在这种方法中，自然产生的多酚、单宁酸(TA)和金属离子在底物存在的情况下简单地混合在一起。金属离子对多酚的吸附和同时交联TA导致了薄膜沉积。TA的相邻羟基为金属离子提供了螯合位点，而TA上大量的没食子基团促进了高效的配位驱动交联，从而形成三维稳定的金属-酚网络(MPNs)。此外，薄膜沉积在几分钟内就完成了，而且TA和金属离子很容易获得，而且价格便宜[8-9]。从而得到了一种利用植物多酚及其类似物的多功能性来形成多功能涂层的生物启发方法7。同时MTT和细胞荧光可见单宁酸螯合氯化钙金属网格结构以及接枝氯己定无明显毒性。单宁酸和氯化钙的络合亲水性的提高以及接枝氯己定的降低间接说明接枝成功，此外，选用较低浓度钙离子络合单宁酸是由于低浓度的钙离子溶液体系较高浓度稳定，
综上所述，本项研究采用单宁酸和氯化钙黏附再钛表面接枝氯己定。生物学评价结果显示氯己定修饰赋予钛抗菌性能，同时未严重影响钛的细胞相容性，同时保证了钛的细胞相容性及持久稳定性。同时可发挥多酚以及钙离子的相应功能，在种植体和骨修复材料的钛表面修饰中具有应用价值。
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站长QQ:729038198
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