基因组学与应用生物学，2013年，第32卷，第4期，第540－547页Genomics and Applied Biology,2013,Vol.32,No.4,540－547
评述与展望
Review and Progress
李汛段增强*
中国科学院南京土壤研究所，土壤与农业可持续发展国家重点实验室，南京,210008*通讯作者,zqduan@issas.ac 摘要根系分泌物是植物根系释放到根际环境中的有机物质的总称，对土壤结构形成、土壤养分转化、植物养
分吸收、土壤微生物分布、环境胁迫缓解等方面都具有重要作用。但是，由于土壤中微生物对根系分泌物的降解以及根系分泌物本身含量低、
无线收发器
成分复杂，根系分泌物的研究方法一直是植物营养学与土壤科学的研究热点和难点。
近年来，一些新的实验技术和研究方法被应用到对植物根系分泌物的研究中。本文对目前在根系分泌物研究中应用较多的以及新发展起来的各种收集、分离和鉴定方法进行了综述，希望有助于相关研究者在针对不同的研究对象和目的时选择出可行、合适、高效的根系分泌物研究方法和技术。 关键词
灯管支架
根系分泌物，收集，分离纯化，鉴定
Progress on the Research Methods for Root Exudates
Li Xun Duan Zengqiang *
State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing,210008*Corresponding author,zqduan@issas.ac DOI:10.3969/gab.032.000540
Abstract Root exudate is a general term for a group of organic compounds released from the plant roots to rhizo-sphere,and plays an important role in formation of soil structure,transformation of soil nutrients,absorption of nu-trients by plants,distribution of soil microbe,alleviation the environmental stress,and so on.Furthermore,owing to
the degradation by the soil microbe as well as the low concentration and complex composition nature of itself,root exudate and its research methods are always the hot spots and challenges.Recently,several novel experimental tech-niques and research methods have been developed and applied in the research on root exudates.In this paper,the collection,separation,purification and identification of root exudates are reviewed,which will be helpful to re-searchers to choose a feasible,suitable and efficient method to their certain object and purpose.Keywords Root exudates,Collection,Separation and purification,Identification 基金项目：本研究由国家自然科学基金(41101272)和土壤与农业可持续发展国家重点实验室优秀青年人才项目共同资助
对根系分泌物的研究起源于18世纪末，1795年Plenk 等发现列当类植物只有在寄主根存在时才能萌发，因此推测植物可以通过根系向外分泌一些物质；1888年Halsted 观察到细菌围绕苜蓿的根尖部分繁衍，于是提出了这是受到了根尖细胞分泌底物的刺激(Curl and Truelove,1986)。20世纪中期以来的研究表明，在植物生长过程中，根系在从生长介质中摄取养分和水分的同时也向生长介质中溢泌或分泌大量的有机物质，即为根系分泌物(张福锁,1992)。根系分泌物对土壤结构形成、土壤养分转化、植物养分吸收、土壤微生物分布、环境污染修复等方面具有重要的作
用，因此对其研究也始终是土壤形成、
植物营养、土传病害、土壤微生物、土壤环境等多个领域的热门话题。
但是，根系分泌物作为土壤微生物可直接利用的底物，在土壤中会迅速被微生物降解，再加上根系分
泌物本身含量较低、
组分复杂，使得其组成和含量随土壤类型和根际环境的变化差异很大，因此直接研究根系分泌物困难很大，这也迫切需要根系分泌物研究方法的革新。目前已报道的研究工作中，缺乏统一、有效、权威的根系分泌物收集、分离纯化和鉴定方法，制约着该领域的进一步发展。本文对目前在根系分泌物研究中应用较多的以及新发展起来的各种收集、分离
基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology
和鉴定方法进行了综述，希望有助于相关研究者在针对不同的研究对象和目的时选择出可行、合适、高效的根系分泌物研究方法和技术。
1根系分泌物的收集方法
目前已报道的收集根系分泌物的方法按不同的分类方法有多种划分(Neumann et al.,2009)。以培养植物的方式不同，可分为水培收集、基质培收集和土培收集；以体系是否灭菌，可分为敞开体系收集和
密闭无菌体系收集；以收集是否在原位条件下，又可分为扰动根系收集和原位根系收集。在这些方法中，在密闭无菌条件下收集到的根系分泌物能较为准确的反映其中有机物质的总量；在土培条件原位收集法获得的根系分泌物则能较为真实的反映根系分泌物的实际情况。所以，根据不同的实验目的，研究者可采取相应适宜的收集方法(刘芷宇等,1997)。
1.1水培收集法
水培收集法是最常用的根系分泌物收集法。该方法是将植物进行营养液培养，在特定时期将植物取出，用蒸馏水清洗去表面粘附物和养分离子，放入清水或含有微生物抑制剂的营养液中培养一段时间后，将培养液过滤，通过树脂富集除去养分离子后，即为根系分泌物(Diez and Dusenbery,1989;Shen et al.,2002)。
水培收集法不需要特殊的收集装置，操作简便，在一定程度上能反映植物中某些特定根系分泌物的变化。但是水培收集法无法做到严格无菌的环境，虽然微生物抑制剂可较好的抑制微生物的活性，但该类物质可能会对植物生理产生不良影响，所以一般只能采用尽量接近无菌的条件并尽可能缩短收集时间。另外，水培植物一般根毛发育较少，没有机械阻力，与真实的土培条件下生长的通气情况、养分分布、根系分支结构有较大的区别，所以该方法只能代表植物在水培条件下的分泌情况。
1.2基质培收集法
基质培收集法常用的基质有石英砂、玻璃珠和琼脂等。石英砂或玻璃珠培养方法是将植物培养在营养液中，用石英砂或玻璃珠固定其根系，培养一段时间后将基质取出，用蒸馏水洗涤除去养分离子，再用有机溶剂浸泡提取基质表面的有机物，最后将提取液过滤浓缩即得根系分泌物(Yoshitomi and Shann,2001;B-oeuf-Tremblay et al.,1995)。由于石英砂或玻璃珠的主要成分是二氧化硅，惰性较强，不影响植物的正常生长，并且植物根系的通气状况较好，还有一定的机械阻力，这些都使得植物根系的生长较水培法更接近土壤培养的实际情况。但是，在培养过程中，石英砂或玻璃珠培养也难以做到无菌条件，使得砂或玻璃表面容易生长青苔，干扰对植物根系分泌物的鉴定。
琼脂培养是研究植物根际环境的常用方法。一般是将植株幼苗生长在琼脂介质中，待植物生长到一定时期，将其根系周围的琼脂加热溶解，使之与植物根系分离，过滤后的滤液即为根系分泌物(Hoffland et al., 1989;Wu et al.,2001)。琼脂培养法收集根系分泌物也较为简单，但一般只适用于培养小型植物的苗期实验，并且也要防止琼脂被微生物污染。
1.3土培收集法
土培收集法是在土培的植物生长一段时间后，将其根系取出，用蒸馏水洗下根际土壤，振荡后离心或过滤，即得到根系分泌物。或者是将生长到一定阶段的植物从土壤中取出，将其根系表面土层冲洗干净，再用蒸馏水淋洗根系，淋洗液作为根系分泌物。土壤培养是最常见的植物培养方式，植物根系生
长最接近于自然条件下的状况，由于土壤颗粒的机械阻力，根系分泌物的量要比水培收集的量更多，且得到的根系分泌物与植物自然生长条件下的实际分泌情况更加接近。但是土壤中微生物种类、数量繁多，会迅速将植物根系分泌物分解利用。另外，在植物根系与土壤剥离时，根系极易受到损伤，收集的溶液中就会包含很多根系本身的内含物和伤流液。
对此，有研究者将植物种植于根箱中，用尼龙网将根箱分成三室，中间种植物，两边装土。将离子膜、纤维素薄膜或者层析滤纸剪成根生长的形状，覆盖在根系的表面，关闭根箱。植物生长一段时间后，打开根箱，小心除去根表土壤，将附着在根系表面的树脂膜或滤纸片取出，用浸提液多次浸洗，所得溶液即为所收集到的根系分泌物(申建波,1998)。这种收集方法操作方便，可以反映植物根系各个部位的分泌状况。但打开根箱除去根际土还是扰动了根系的生长，并且这种方法一般只适用于小型植物或苗期植物。
1.4其它方法
上述的几种方法是最常用的根系分泌物收集方法，根据研究目的和研究对象的不同，一些研究者自行设计了特殊的装置来收集根系分泌物。
连续根系分泌物收集系统是将植物培养在连接有根系分泌物收集器的容器中，培养液在向下渗透过
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植物根系分泌物的研究方法Progress on the Research Methods for Root Exudates
程中将根系分泌物淋洗下来，在经过根系分泌物收集器时有机物被富集，而含有无机离子的培养液则循环回到培养容器中(Tang and Young,1982)。根系分泌物收集器中一般使用大孔吸附树脂富集根系分泌物，该树脂可通过范德华力从水溶液中吸附有机物，实现有机物的富集和分离。收集完成后，用合适的洗脱剂可将根系分泌物从树脂上洗脱下来。连续根系分泌物收集系统可以在植物培养的同时，不扰动根系生长的情况下，实时、自动、连续的收集根系分泌物，目前被越来越多的应用于根系分泌物的研究中。但在使用时，培养容器、收集装置以及各连接管道内依然要防止细菌或藻类的滋生。同时培养液的流量也是影响收集结果的关键因素，流量太大会使植物根系始终处于无氧状态，影响了其正常生长；而流量太少则会带入大量空气，使得循环系统无法正常工作。
澳大利亚科学家设计了提取环来收集水培白羽扇豆的根系分泌物(Keerthisinghe et al.,1998)。他将白羽扇豆的根系平铺在生长板上，把提取环的凹槽卡在根系的特定部位，提取环的底部与根系以及生长板用密封胶密封，收集一段时间后环内溶液，即作为根系分泌物。该方法只适用于水培，且只能收集少部分根的分泌物，收集数量有限。
在提取微量土壤溶液的张力计的启发下，德国科学家设计了原位收集根系分泌物的微量提取杯(G觟t-tlein et al.,1996;Dieffenbach et al.,1997)。将根箱倾斜30°培养植物，使植物根系紧贴着根箱下部的玻
璃板面生长，玻璃板面上密布外端封口的毛细管。当植物生长到一定阶段，打开根系周围毛细管的封口端，连接抽气泵，可将根际土壤溶液抽出，作为收集到的根系分泌物。该装置收集到的根系分泌物能较为准确的反应植物根系的实际情况，对根系扰动也很小，但其结构较为复杂，毛细管道也比较容易堵塞，不利于长时间的收集，该系统也无法进行大型植株的培养。
Chen等(2010)利用环形中空纤维取样器，提取了根际土壤溶液。他们将中空纤维管弯曲成环形，埋入植物根区的土壤中，在需要取样时，将土壤的持水量调整到80%，用注射器将渗入中空纤维管的土壤溶液抽出。该方法可以用来原位非损伤的提取根际土壤溶液，分析其中的根系分泌物，但由于土壤组成的复杂性，不能保证收集到的有机物全部来源于植物根系。
Yang等(2012)设计了一种底部含有尼龙网室的根箱来收集大豆的根系分泌物。该根箱底部有2cm高的暗室，顶部有尼龙网与上层土壤栽培部分隔离，大豆根系可以透过尼龙网在暗室中生长形成根垫，定期收集根垫层的溶液作为植物的根系分泌物。该根箱可使植物生长在与自然条件相近的土壤中，收集根系分泌物时也基本不会干扰植物的生长，但根垫处的根系密度要远大于上层土壤中正常生长的根系，因此收集到的根系分泌物的数量可能要比真实情况放大很多。
最近，Oburger等(2013)设计了一套新颖的根箱来收集土培玉米苗的根系分泌物。该根箱的特点在于下半部有一条狭长的垂直缝隙，缝隙的开口和后半面与周围土壤用尼龙网隔开，前半面为一布满小孔
的透明有机玻璃。当玉米苗的根系生长到狭缝中后，就可以在狭缝的高处注入营养液，低处与根系接近的开孔抽取根系分泌物。该装置既不破坏根系与土壤间的自然生长状况，也能较好的选择收集位点，是目前最具潜力的根系分泌物收集装置。
2根系分泌物的分离纯化方法
收集到根系分泌物是一个复杂的有机混合物，在进行组分鉴定和定量分析前要进一步分离纯化。在分离纯化过程主要是根据不同组分之间的理化性质不同，利用合适的方法分离纯化。
2.1过滤与超速离心法
不同分子量的分子膜和凝胶孔径一般介于0.001~1.000μm之间，根据根系分泌物中的蛋白质、多肽及氨基酸分子尺寸的差异，可利用分子膜和凝胶的超滤技术将其有效分离(Pant et al.,1994)。使用超速离心时，根系分泌物中密度不同的组分所受的离心力不同，因此离心完成后会分布于不同层面上，这样就可以将各个组分有效分离。
2.2萃取法
将根系分泌物的水溶液调节pH值后，再用有机溶剂萃取也可以将其主要组分有效分离。将根系分泌物的水溶液pH调节到11，用乙酸乙酯萃取，可得到碱性组分；再将剩余的水溶液pH调节到7，用乙酸乙
酯萃取，得到的是中性组分；最后剩余的水溶液pH调节到2，用乙酸乙酯萃取得到的是酸性组分。这样根系分泌物可粗分成碱性、中性和酸性三大组分，可用于不同pH环境的谱分析鉴定(Yu and Matsui,1994;Hao et al.,2007)。
2.3离子交换法
根系分泌物中各组分的极性有较大差异，可以根据其在离子交换树脂上的交换能力不同实现分离。阳溴化丁基橡胶
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基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology
双面胶贴
离子交换树脂表面上带有磺酸根(－SO
3
－)或羧酸根(－COO－)等负电荷官能团，可以和介质中的钾、钙、镁、氨基酸等阳离子发生交换或吸附；而阴离子交换树脂
表面带有季胺基(－NR
防盗门报警器
3
+)等正电荷官能团，用以与介质中的硝酸根、磷酸根、硫酸根、有机酸根等阴离子发生交换或吸附。因此，可以将收集到的根系分泌物依次通过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，这样，其中的氨基酸将被阳离子交换树脂吸附，可用氨水溶液洗脱下来；有机酸则被阴离子交换树脂所吸附，可进一步用甲酸溶液洗脱下来；而未被离子交换树脂所吸附的中性组分，主要是一些糖类物质(Canvin and Beev-ers,1961;Gransee and Wittenmayer,2000)。这样，通过离子交换树脂，根系分泌物可被分离纯化为氨基酸、有机酸和糖类三大组分，可用于进一步分析鉴定。
3根系分泌物鉴定方法
根系分泌物常用的鉴定技术主要是谱的分离、光谱的鉴定及其二者的联用技术。对于已知的、主要的组分，可以用高效液相谱进行定性、定量的分析；对于极微量的、未知的组分可以用谱－质谱联用技术进行鉴定；其它谱学手段可以佐证特定化合物的分子结构。
3.1高效液相谱
高效液相谱是谱的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将流动相泵入装有固定相的谱柱，混合样品中各组分在谱柱上被先后洗脱下来，进入检测器进行检测，从而实现对样品
的分离和鉴定。根据对样品组分的分离机理，可分为吸附谱、分配谱、离子交换谱和分子排阻谱四类(Dorsey et al.,1998)。
3.1.1有机酸
植物根系分泌物中的有机酸主要有乙酸、草酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸等，还有少量的甲酸、丁二酸、马来酸、酒石酸等。高效液相谱法分离有机酸可以使用离子谱法和反相高效液相谱法两大类。离子谱法中又以离子交换谱和离子排斥谱为常用的两种分离方法。
离子交换谱法主要利用了有机酸在水溶液中可以部分离解成羧酸根和氢离子，羧酸根与阴离子交换柱中固定相上的阴离子基团交换而被保留下来(Str觟m et al.,1994)。各种有机酸的离解度、电荷数以及亲水性上的差异使其在谱柱中保留时间不同而分离开来。离子交换谱法一般采用电导检测器，也可采用紫外检测器或二极管阵列检测器。
在离子排斥谱法分离模式中，有机酸的离解由溶液中Donnan平衡决定，容易离解或极性较强的有机酸在谱柱上的保留时间较短(Fischer,2002)。固定相以大交换容量的阳离子交换树脂为主，淋洗液多采用强酸的稀溶液，使得有机酸的离解受到抑制，因此电导检测器的灵敏度一般不如紫外检测器高(Shen et al.,2002;Sandnes et al.,2005)。
反相高效液相谱法分离有机酸一般使用弱极性的ODS固定相，流动相极性比固定相稍大。在谱柱中，各种有机酸由于在固定相和流动相中的分配系数不同而被分离。流动相一般选择酸性缓冲溶液，可以抑制有机酸的离解使其尽可能的以分子形式存在(Pérez and Ormeňo-nuňez,1991)。因此，常用紫外检测器，为了改善选择性或提高灵敏度，也可采用电化学检测器和二极管阵列检测器(Cawthray,2003)。
3.1.2氨基酸
根系分泌物中所含氨基酸包括甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸、氨酸等。氨基酸的经典高效液相谱分析法主要采用磺酸盐阳离子交换树脂，利用氨基酸样品在pH2~3时全部转变为阳离子的特性，调节流动相的pH和离子强度，将各种氨基酸逐一分离，用邻苯二甲醛在巯基存在条件下柱后反应生成带荧光的物质，进行荧光检测(Nakamuraetal.,2007)。也可利用茚三酮柱后衍生，紫外检测(Choi et al.,2011)。该谱方法的不足之处在分离时间长，检测灵敏度相对较低，价格昂贵。
为了节省仪器成本，简化操作步骤，柱前衍生反相谱技术在氨基酸分析中逐渐得到应用，衍生后的氨基酸一般键合在C18柱上，利用液液分配原理进行分离。流动相多以醋酸盐或磷酸盐缓冲液为主，以乙腈、甲醇或四氢呋喃为调节剂(Johnson et al.,1996)。这使得分离时间大为缩短，衍生化试剂选择
更广。紫外衍生化试剂主要有异硫氰酸苯酯、邻硝基苯磺酰氯等。邻苯二甲醛、荧光胺、丹酰氯、偶氮苯磺酰氯等荧光衍生化技术的采用可使检测灵敏度比紫外检测提高了两个数量级。
近年来，阴离子交换谱－积分脉冲安培检测法被开发出来(Clarke et al.,1999)。该法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电
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位可在贵金属电极表面发生氧化反应，从而实现氨基酸的阴离子交换谱分离和积分脉冲安培检测。与其他方法比较，该法无须进行柱后或柱前衍生反应，灵敏度较高，大多数氨基酸的检测限小于1pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。
3.1.3糖类
糖类是植物体内重要的结构、能源和功能物质，根系分泌物中也有大量的糖类。低分子量糖类物质的谱分析法主要有离子交换谱法、正相谱法和配体交换谱法(Montero et al.,2004)。离子交换谱法是目前糖类物质谱分析的主要方法之一，通过改变固定相上离子交换基团类型可以获得不同的分离效果。糖分子上的羟基呈弱酸性，电离常数也很低，约为10~12。因此，在阴离子交换谱法分
析糖时，流动相的pH值要大于12，并且HPLC系统也要经受同样的pH条件。由于糖类这样的多羟基化合物可和硼酸反应产生带负电荷的联合体，因此，可以用硼酸缓冲溶液作流动相，通过糖和硼酸反应，进行糖类的分离。但是，不同组份的保留时间差别很大，二聚糖和单糖的分离要耗费很长时间，谱峰也比较宽。目前，分析中通常使用梯度洗脱模式，硼酸缓冲溶液和流动相的pH值随时间的变化而变化，因此，无法使用示差折光、蒸发光散射等检测方法。
正相谱法分析单糖和低聚糖非常有效。用硅胶固定相和胺丙基化学键合作为柱填料，乙腈和水作流动相。正相谱法分析中，糖在谱柱中的保留取决于糖的划分，通过调整乙腈和水的比率可以控制糖的分离及保留时间(Lugtenberg et al.,1999)。但由于固定相自身的水解，加上固定相上的氨基与糖的羰基之间易形成希夫碱，谱柱使用寿命较短。
配体交换谱法是通过选择Ca、Na、Pb等配位离子，可以改变对单糖的选择性，从而改善它们的分离(Gomis et al.,1988)。在分析过程中，糖主要通过与金属配位离子结合而被保留，保留时间取决于它们和金属性相对离子的水合分子相互作用所产生的配合物的稳定性。此方法的优点是只用水作流动相，分析简单，因此，近来一系列各式各样配体离子谱柱已经得到了广泛的商业应用，但价格较高。
由于糖类物质不带发基团和荧光基团，在液相谱分析过程中难以通过紫外和荧光检测器检测，目
前液相谱法普遍使用示差折光检测，但这种检测方法对压力、温度、流速及流动相组成的变化很敏感，不能采用梯度洗脱。蒸发光散射检测器可以检测无紫外吸收的化合物，但要求流动相必须完全蒸发，因此不能用无机盐调节pH。脉冲安培检测器可检测pmol级以下的糖物质，且不需衍生反应，但其电极容易被污染，而且氨基酸和有机酸等杂质物质会对其检测有严重的干扰。
因此，为了增强检测的灵敏度和选择性，在液相谱法检测糖类时，经常通过选择适当的试剂与样品衍生，使之产生紫外可见吸收或荧光(Gao et al.,2003)。在柱前衍生法中，荧光衍生试剂有2－氨基嘧啶、2－氨基吖啶酮、氨基苯甲酸酯类和酰肼类化合物；紫外衍生试剂有甲氧基苯胺、对硝基甲苯氯、2,4－二硝基苯、6－氨基喹啉、苯甲脒。糖类物质柱后衍生比较经典的方法之一是使用含有某些显试剂(如苯酚，地衣酚，蒽酮，咔唑，间二苯酚等)的强无机酸溶液，对单糖进行脱水、环化作用，使其转变为糠醛。但缺点在于使用的强酸具有腐蚀性，损耗流动相传送系统和检测器。近年来，一些新的衍生试剂被发展起来(Honda,1996)：精氨酸、苯甲脒、脒基牛磺酸、胍基类物质可作为柱后荧光衍生试剂，酰肼类物质、四氮唑蓝、对氨基苯甲酸可作为柱后紫外衍生化试剂。不同的衍生试剂针对不同糖的种类以及在特定的流动相pH、温度等条件才能完成衍生化，因此，人们可以根据不同的研究目的和条件，选择不同的衍生化试剂和分析检测方法。
3.2谱－质谱联用技术
质谱是离子(如分子离子，碎片离子等)按质荷比(m/z)大小依次排列的谱图，通过对样品气相离子质荷比大小和丰度的测定进行化合物的组分分析和结构分析，是化合物的“化学指纹图谱”之一。
3.2.1气相谱－质谱联用(GC-MS)
用质谱法作为气相谱(GC)的检测器己成为一项标准化技术被广泛使用，在有机混合物质的分析方面发挥着重要的作用。根系分泌物中，大多数组分带有羟基、羧基、胺基等极性较强的官能团，因此首先要将样品硅烷化，再使用GC-MS测定混合物，可了解有机混合物的组成及大致的相对含量情况(Yu and Mat-sui,1994;Wu et al.,2001)。
3.2.2高效液相谱－质谱联用(HPLC-MS)
由于GC-MS只适合测定易挥发、相对分子量小和热稳定的化合物，但在实际分析中，80%左右的化合物都具有强极性、低挥发、大的相对分子量和热不稳定的特性使得无法采用GC-MS的方法进行分析，所以液相谱(LC)与质谱法的联用技术逐渐发展起来。根系分
植物根系分泌物的研究方法Progress on the Research Methods for Root Exudates
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