【⼲货】Westernblot操作步骤
实验原理：
Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是⽤抗体检测蛋⽩的重要⽅法之⼀。Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质,“探针”是抗体,“显⾊”⽤标记的⼆抗。经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。 内参:
手持式按摩器
WB过程监测以及⽬的蛋⽩定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照。抗生素制作方法
1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常⼯作，如果⼀个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的；
2、起半定量的标准的作⽤，内参⼀般选择管家基因编码表达的蛋⽩，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋⽩表达量的标准；
实验步骤
⼀、蛋⽩样品制备（组织中总蛋⽩的提取）
第⼀步：
法（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放⼊打样管，放⼊打样机打样。
法（2）实验室研钵研磨：取稍⼤于0.1g的样品放⼊研钵中，来回磨，⾄粉末状，⽤头刮取收集⼊离⼼管。
注：任何操作都要在液氮中进⾏，并且要将头和离⼼管提前泡在液氮中。
第⼆步：取出的样品放置冰上1-2h（中间混匀5-6次）直⾄裂解完全。
第三步：样品离⼼*2，取上清于新的EP管中。
（离⼼条件：13000rpm，4℃，30min）
注：离⼼机提前预冷⾄4℃。
⼆、蛋⽩含量的测定
第⼀步：在96孔板第⼀列1-8分别为浓度为0,1,2,4,6,8,9,10倍的蛋⽩标准液+⽔=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
第⼆步：在96孔板后⾯⼏列依次加⼊稀释的蛋⽩样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
注：原液浓度太⾼时进⾏稀释，⽤裂解液稀释。
三、电泳
第⼀步：清洗玻璃板
第⼆步：配胶
第⼆步：配胶
（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧，然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。
（2）配分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。待胶⾯升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加⼀层⽔，液封后的胶凝的更快。
注：加⽔液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
（3）当⽔和胶之间有⼀条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层⽔并⽤吸⽔纸将⽔吸⼲。配浓缩胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳⼦插⼊浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两⼿分别捏住梳⼦的两边竖直向上轻轻将其拔出。
注：插梳⼦时要使梳⼦保持⽔平。
（4）⽤⽔冲洗⼀下浓缩胶，将其放⼊电泳槽中。（⼩玻璃板⾯向内，⼤玻璃板⾯向外。若只跑⼀块胶，槽另⼀边要垫⼀块塑料板且有字的⼀⾯⾯向外。）
第三步：上样
（1）测完蛋⽩含量后，计算含50mg蛋⽩的溶液体积即为上样量。适量蛋⽩加⼊4：1 5*Loading Buffer于离⼼管，100℃⽔中煮5min使蛋⽩变性。放置冰上3min，离⼼15min，13000rpm，4℃。
（2）加⾜够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液⾄少要漫过内测的⼩玻璃板。）⽤微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进⽓泡。将加样器针头插⾄加样孔中缓慢加⼊样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有⽓泡也可能使样品溢出。）
第四步：电泳
浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑⼏分钟；分离胶180V电压跑⾄底端。
第五步：停⽌电泳
纯⽔冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下⽅切⾓做标记，将胶泡在清⽔中。
四、转膜（跑胶时准备转膜⽤品，最主要赶⽓泡）
第⼀步：剪PVDF膜，并提前切个⾓，甲醇中泡2-3min。
第⼆步：将膜、海绵、滤纸⼀起泡⼊1*转膜液中，放4℃保存。
注：转膜液可回收。
第三步：将夹⼦打开使⿊的⼀⾯保持⽔平。在上⾯垫⼀张海绵垫，⽤玻棒来回擀⼏遍以擀⾛⾥⾯的⽓泡。(⼀⼿擀另⼀⼿要压住垫⼦使其不能随便移动。)在垫⼦上垫2层滤纸，⼀⼿固定滤纸⼀⼿⽤玻棒擀去其中的⽓泡。将胶盖于滤纸上，轻轻⽤玻棒擀去⽓泡。将膜⽤镊⼦盖于胶上，并除⽓泡。在膜上盖2层滤纸并除去⽓泡。最后盖上另⼀个海绵垫，合起夹⼦。整个操作在1*转膜液中进⾏，要不断的擀去⽓泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发⽣短路。
第四步：将夹⼦放⼊转膜槽槽中，⿊对⿊，对红。电转移时会产热，过热有可能造成蛋⽩质的降解，同时⼤量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产⽣空隙，引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放⼊冰盒，在冰⽔混合物中进⾏转膜。
注：转膜条件是电流300mA或电压70V，2h；另⼀个约束条件就是电压必须控制在60-70V，调节电流。
第五步：转完后将膜放⼊装⽔的⼩盒中冲洗，倒⽔后，加5%的封闭液，摇床封闭1h。
五．抗体孵育，免疫反应
五．抗体孵育，免疫反应
第⼀步：回收封闭液，加⼊⼀抗，摇床30min-1h，4℃过夜，再孵育30min-1h。
第⼆步：⼀抗回收，⽤PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次）
第三步：加⼆抗，孵育2h。
第四步：⼆抗回收，⽤PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次）
第五步：纯⽔冲洗5-7次，倒掉纯⽔，加化学发光，膜在化学发光中浸泡2-3min，成像。
CSL（利斧科学）电泳个性化定制解决⽅案
根据样本数、胶尺⼨、缓冲液容量的不同提供各种不同的配置组合 Cleaver Scientific的 multiSUB⽔平凝胶电泳装置是由科学家设计的，考虑到实验室环境。我们的 multiSUB⽔平电泳槽提供了⼀个易于使⽤和灵活的平台，以满⾜您所有的⽔平电泳要求。该系统具有⼴泛的槽和托盘尺⼨以及许多梳状选择，可以处理各种电泳实验。我们的multiSUB系列⽔平凝胶装置提供⽬前市场上最通⽤的 DNA和RNA琼脂糖凝胶电泳解决⽅案。MSMINI、 MSMIDI、MSCHOICE、 MSCHOICEST、MSMAXI、 MSCREEN、miniRAPIDE、MSMIDI96和miniONE都提供了⽆与伦⽐的凝胶和缓冲液体积组合，凝胶⼤⼩和样品数量的多功能性。 multiSUB™⽔平电泳系列提供多种针对DNA和RNA琼脂糖凝胶电泳
•采⽤⼀体成型注塑制造，提供耐久，防漏的特性，保证实验安全性和设备持久耐⽤
•嵌⼊式电极设计，更换更加简便
•电极为99.99%的纯钳⾦，同时耐腐蚀
•⽤电安全，顶盖固定在⼀个⽅向上，当移开顶盖时，电源⾃动冲缓冲液中断开
•多种凝胶托盘尺⼨选择，减少使⽤过多的电泳槽
•独特的电泳冷却系统
•按压式的顶盖更⽅便取下
五个⽔平电泳槽选择，提供了⼀个⽆与伦⽐的组合经济的凝胶和缓冲容量凝胶的⼤⼩和样品数的多样选择性。
凝胶尺⼨和样品数量要求可以在每个单元中精确匹配，还可以选择额外的凝胶托盘尺⼨。这减少了需要多个电泳槽来改变凝胶⼤⼩或应⽤。
所有电泳槽的特点是使⽤可移动的紫外线透明托盘。为了获得最佳效率和通⽤性系统可以提供⼀个、两个或三个凝胶托盘选项（取决于电泳槽型号）。易于使⽤，防泄漏的“即插即⽤''凝胶浇注坝被列⼊标准，允许凝胶快速浇注，同时多亚单元⽤于凝胶运⾏。在托盘上没有凹痕或浇⼝凹槽来⼲扰样品的进样。同时也可以使⽤传统的胶带封⼝。.
盖⼦连接器与⼤多数主要电源兼容同时提供额外的适配器可以提供完全的兼容性.
凝胶托盘
卢卡纤维凝胶托盘是紫外透明的没有凹痕或浇⼝通道，减少对样本的⼲扰
独特的ClearSight
ClearSight顶盖解决了冷凝堆积问题，提供⼀个完全透明的顶盖观察凝胶和染料的运⾏进程。这是通过USB实现的电动抽风机内盖。Clearsight盖⼦是可作为完整系统的组件或作为升级。
紧凑和易⽤的omniPAGE垂直电泳提供快速的制胶和上样
Cleaver Scientific提供⼀系列全⾯的垂直电泳系统-包括槽插⼊物和试剂-以满⾜不同凝胶⼤⼩和处理量的各种应⽤和技术。omniPAGE系列包括三种尺⼨的凝胶室，迷你型10 x 10 cm，迷你型20 x 10 cm和波浪型最⼤20 x 20 cm。每个系统都有保证的防漏密封，从⽽实现⽆故障和快速凝胶浇铸。这些系统是SDS-PAGE或原⽣聚丙烯酰胺凝胶的理想选择。每个凝胶罐系统包括⼀个⽆泄漏铸造选项，可铸造您⾃⼰的聚丙烯酰胺凝胶，⽽omniPAGE mini可使⽤所有主要制造商的各种商⽤预制凝胶。
1.—体成型的紧凑机型-耐⽤，防漏的特性提供了安全和长期使⽤的保障可兼容所有主流品牌的预制胶快速制胶和上
自制路由器天线
样，保证了制胶的快速和可靠性通⽤性-可同时⽤于PAGE电泳和⼆维电泳模块，同时也可以通过使⽤同⼀个电泳槽进⾏转印。
三种尺⼨,Mini 10 x 10cm, Mini Wide 20 x 10cm, WAVE Maxi 20 x 20cm，具有许多共同的特点，包括确保⽆漏密封，快速和简单的制胶。内置的制胶跑胶模块，消除了传统制胶过程中玻璃板转移的时间消耗，这⼀过程会导致凝胶损坏和错位。
具有永久粘结垫⽚的玻璃板保证了垫⽚的完美对准。
玻璃板夹芯结构简单，夹在压杆之间，密封使⽤，使⽤⽅便，可使⽤滑动门或WAVE MAXI锁定系统。
这确保了快速安装时间，⽽均匀的压⼒和超软密封确保制胶的防泄漏。
凝胶完成后，将凝胶运⾏模块简单插⼊电泳槽进⾏实验。
omniPAGE MINI垂直电泳组成
1. 顶盖和电源线；
2. PAGE模块；
3. 滑动门；
4. 玻璃；
5. 内缓冲液室；
6. 垫⽚；
7. 外部电泳槽；
8. 制胶底座；
9. 超软制胶垫；10. 梳⼦
操作⽰例
powerPRO电泳电源提供⾏业领先的规格和价值
⽆论您需要⽤于常规⽔平 DNA琼脂糖凝胶电泳的电源，还是对于技术要求很⾼的技术（如⼤幅⾯垂直的 SSCP分析），还是使⽤ IPG条带的第⼀维IEF， Cleaver Scientific都可以通过其全⾯的电源满⾜您的需求。每个电源都有⼀个紧凑的设计，这意味着实验室占地⾯积⼩，⽽解释性的⾃我提⽰菜单使
设置变得容易。此外，这些电源符合
IEC61010标准，这是世界上最严格的电⽓安全标准之⼀。我们的电源采⽤标准的 4毫⽶⾹蕉插头式连接器，与我们⾃⼰的电泳槽和其他制造商的电泳槽兼容。
计时不间断：999 （分钟）闹钟预设模式999（分钟）闹钟
结合卓越的规格，性能，可靠性和⽆与伦⽐的价值
每个电源都有⼀个2.4”的LCD显⽰器，显⽰可⽤的选项以及当前的运⾏条件。恒定的电压，电流和电源选项，以及预编程或⽤户可编程程序，允许⽤户保存和重复他们的实验条件。5 组电源输出意味着相同数量电泳槽只需要较少的电源，当同时运⾏多个电泳槽时节约成本和时间。
3AMP：完美兼容垂直电泳omniPAGE Maxi. 同时兼容转印系统omniBLOT和半⼲转印.
规格 300V, 3000mA, 300W, powerPRO 3AMP是专为⼏乎所有的⼤电流电泳应⽤⽽设计的。
半导体制冷空调powerPRO 3AMP的⾼电流输出能⼒⾮常适合于具有⾼强度平板电极，特别是Cleaver Scientific omniBLOT
maxi,VS20WAVE和半⼲式转印系统。电传输可以在恒定或可编程模式下以定时运⾏来执⾏，以防⽌过热和缓冲液耗尽。在恒定模式下可延长到最⼤999分钟的运⾏时间对于以恒定⼩电流进⾏的过夜转换也是有⽤的。 powerPRO 3AMP 共享其他powerPRO型号的内置协议和常数参数特性。
300V：常规⽤于⽔平电泳，如multiSUB Mini, Midi and Choice，也可⽤于垂直电泳omniPAGE Mini.
powerPRO 300是⼀套多样性的平台电源兼容不同的电泳应⽤在300V, 700mA和150W功率PR0300具有⼏乎两倍的电流和电⼒市场领先的等效单位。⾮常适合与 Cleaver Scientific的多个SUB范围的⽔平电泳系统和 omniPAGEMini垂直电泳系统⼀起使⽤。powerPRO 300甚⾄已经从运⾏CleaverScience的每个电泳系统内置了预置协议，并且允许⽤户创建和保存他们⾃⼰的系统的协议。
500V：常规应⽤于⽔平电泳，如multiSUB Mini, Midi and Choice.也可⽤于垂直电泳omniPAGE Mini、Cleaver Scientific DGGE变性梯度电泳、垂直电泳omniPAGE Maxi。
powerPRO 500具有最⼤500V、 800mA和300W电压、电流和功率输出，是⼀种优秀的通⽤电源，适合最⼴泛的电泳应⽤。
它可以在⼀个恒定或可编程的设置下运⾏多达五个单元，并且能够存储多达30个编程⽂件，每个⽂件只需6个步骤。这使得powerPRO 500⾮常适合需要电⽓参数需要细微和逐步变化中受益的应⽤。
例如使⽤Cleaver Scientific VS20-DGGE和WAVE系统的DGGE和⼤格式垂直PAGE电泳。powerPRO 500甚⾄在运⾏CleaverScience的每个电泳系统时都内置了预置协议，并且允许⽤户创建和保存他们⾃⼰的程序。
chemiLiTE凝胶成像仪
通过专⽤的化学发光成像仪传递⾼敏感度和易⽤性。
Cleaver Scientific提供⼀系列凝胶成像系统，从我们的⼊门级microDOC Basic到⼀体化的DNA和蛋⽩质成像omniDOC。 omniDOC系统提供了⼀个简单但复杂的成像解决⽅案，同时提供了许多最⾼规格系统中包含的功能，但没有额外的价格。omniDoc适⽤于⼤多数荧光和⽐⾊凝胶的成像，具有⾼分辨率500万像素 CMOS传感器，带滑出式紫外线透射器，可选蓝⾊外照射模块和⽩光表。 Cleaver Scientific还为化学和荧光成像提供⼀系列化学发光记录系统。所有系统都包括直观的采集和分析软件，使采集和分析凝胶尽可能容易。
系统的化学发光系统可捕获化学发光信号，以检测 Western blots上的⽬标蛋⽩，其灵敏度可与膜成像媲美或优于膜成像毒草解毒剂
•占⽤空间⼩
紧凑的尺⼨占⽤最⼩的实验空间，允许更多的实验空间
•⾼量⼦效率(QE)相机
检测微弱的条带
•⾃动化学发光捕获
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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