1)烘片
▷在60℃烘箱放置2-4小时,使蜡流失。
2)脱蜡、脱水
▷二甲苯溶液中脱蜡,2次,每次5min
▷100%乙醇,2次,每次3min
▷95%乙醇,1次,每次3min
▷90%乙醇,1次,每次3min
▷85%乙醇,1次,每次3min
▷H2O,1次,每次3min
泄洪道
3)固定
▷样本切片在冰的甲醇中放置10min (甲醇溶液在-80℃预冷)
▷用冰的PBS溶液洗2次,每次3min (PBS溶液在-20℃短暂预冷)
4)透化
▷用含0.25%Triton X-100的PBS孵育石蜡切片10min (200mlPBS+500ul Triton X-100)
▷用PBS溶液洗3次,每次5min
5)第一荧光标记
▷用PBST配置1%的BSA封闭液,将切片在封闭液中孵育1h
▷4℃冰箱,一抗过夜 (1%BSA稀释,名称、货号、使用浓度Anti-G3BP2 antibody ab86135 防粘贴油漆8ug/ml)
▷rna测序
用吸走一抗液体,PBS溶液洗3次,每次5min ▷二抗室温1h (避光,1%BSA稀释,名称、货号、使用浓度Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (FITC) ab97063 1:400)
▷用吸走二抗液体,PBS溶液洗3次,每次5min(避光条件下进行)
6)第二荧光标记
▷4℃冰箱,一抗过夜 (避光,1%BSA稀释,名称、货号、使用浓度Anti-Fibronectin antibody ab2413浓度1:200? OR Anti-alpha smooth muscle Actin antibody ab5694浓度1:100?)
▷用吸走一抗液体,PBS溶液洗3次,每次5min
▷二抗室温1h (避光,1%BSA稀释,名称、货号、使用浓度水暖炉Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 555)ab150074浓度1:500?)
真空海绵吸盘
▷用吸走二抗液体,PBS溶液洗3次,每次5min(避光条件下进行)
3d打印建筑7)DAPI对比染
▷2µg/ml的DAPI,15min
▷用PBS冲洗3次
8)封片
▷用移液吸中性树脂一小滴,盖上盖玻片,用指甲油涂抹边缘,待风干后显微镜照相