免疫组化
铅封号存放位置:糖尿病检测仪一抗、二抗、DAPI计费系统放在冰箱一层;山羊血清放于冰箱二层。
所用试剂:10%山羊血清;PBST(PBS+%Triton);一抗(1:1000);二抗(1:500);PBS(配制方法:将一个1L的烧杯洗净晾干,称量8g NaCl, 冷却塔减震器KCl, Na2HPO4, KH2PO4放至烧杯中,向烧杯中添加800ml ddwater,放在磁力搅拌器上搅拌,调PH至,后定容至1L);DAPI(用PBS配制,1:10000);抗荧光淬灭封片液
仪器或器皿:24孔板(洗净晾干,为了便于后续操作,要将24孔板盖子和板子上画一条横线以防止盖子盖错,在盖子上划线对24孔板按照其作用(如:装有洗一抗用的PBST的孔,则标明PBST(洗一抗用))进行分区);室温摇床 实验步骤:
1、封闭:将冷冻切片所得的脑片进行封闭,封闭用1ml山羊血清+9ml PBST,每孔加800微升,将脑片用玻璃钩取出放入24孔板中,放于铅封线
4℃过夜。 2、封闭完成后,用玻璃钩将脑片取出放于添加了一抗(1:1000,一抗用封闭液配制)(rabbit or mouse or chicken)的24孔板中进行孵育,置于室温摇床,8h(记得计时),之后放于4℃过夜。(一抗有两种,即单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体特异性较强,但亲和性较弱;多克隆抗体特异性较弱,但亲和性较强)
3、用一抗孵育后,将脑片用玻璃钩取出,放于添加了800微升PBST的24孔板中进行洗涤,洗3次,每次15分钟,每次洗涤后都要将脑片重新用玻璃钩取出放于添加了新的PBS的24孔板中,放于室温摇床。
4、之后,将脑片从含PBST的24孔板中取出,放入添加了二抗(1:500,一般用封闭液配)的24孔板中,放在室温摇床上孵育2h,每孔加800微升。(二抗一般根据一抗来选择,如一抗为鼠源的,二抗就选择抗鼠的;一抗为兔源的,二抗就选择抗兔的)
5、二抗孵育后,将脑片用玻璃钩取出,放于装有PBST的24孔板中洗5次,每次洗涤都要将脑片取出放于呈有新的PBST的24孔板中,每次15分钟,放于室温摇床。
6、最后一次用PBST洗过之后,将脑片用玻璃钩取出,放于含有PBS的24孔板中洗1次,10分钟,室温摇床。
7、之后将脑片用玻璃钩取出,放在含有800微升DAPI(用PBS配制,1:10000)的24孔中进行染,室温摇床10分钟。
8、再将脑片取出放在含有800微升PBS的24孔板中洗1次,10分钟,室温摇床。
9、展片:将载玻片和盖玻片洗净烘干,将载玻片放平于实验台上(正面朝上,反面最好垫上一个玻璃皿),在载玻片上滴加水或PBS,用玻璃钩取出脑片在滴加有水或PBS的载玻片上将脑片展开,动作要轻柔。等待晾干后,在脑片上方滴加抗荧光淬灭封片液,缓缓盖上盖玻片(注意不要留有气泡)。 10、将制备好的片子放至专门装玻片的盒子中,之后进行拍照观察(633用confocol)
注意事项:操作过程中避免强光照射,防止荧光淬灭。