植物器官和组织培养的基本程序

离体的植物器官和组织在人工培养条件下，通过不同的器官发生途径，形成体细胞胚或茎芽，进一步再生成完整植株。因此，植物器官和组织培养的基本程序包括：无菌外植体的获得、初代培养物的建立、形态发生、植株再生以及培养产物的观察记载。

一、无菌外植体的获得

从自然界和室内采集的植物器官和组织材料携带有各种微生物，这些污染源一旦进入培养容器中，造成培养基和培养材料污染，实验无法进行。所以，污染是组织培养的一大障碍。利用各种灭菌剂可以进行外植体的灭菌，但不同植物或同一植物不同器官和组织的带菌程度不同，所用灭菌剂的种类、浓度及灭菌方法也不尽相同。

(一)茎尖、茎段、叶片的灭菌

灭菌前外植体用清水冲洗，茸毛较多的外植体用皂液洗涤后再用清水冲洗、用吸水纸吸干表面水分；将外植体浸泡在0.1%～0.2%的溶液中2～10min，或先在70%～75%酒精中浸数秒，然后在10%次氯酸钙溶液中浸泡10～20min。或先在70%～75%酒精中浸

泡数秒，再在2%次氯酸钠溶液中浸泡15～30min进行灭菌；灭菌后倒掉灭菌液，无菌水冲洗外植体3～5次，置外植体于无菌滤纸上吸干表面水分，适当分割后接种。

(二)根、块茎、鳞茎的灭菌

这类材料生长在土中，灭菌较困难，且挖取时易受损伤。所以灭菌前应仔细清洗，对凹凸不平及鳞片缝隙处，需用软刷清洗，并切除损伤部位。灭菌时应增加灭菌时间或增大灭菌剂浓度，如将外植体浸泡在0.1%～0.2%溶液中5～12min，或在70%～75%酒精中浸数秒，然后用6%～10%次氯酸钠溶液浸5～20min进行灭菌。灭菌后的操作步骤同上。

(三)花蕾的灭菌

未开放花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态，所以采摘后可直接灭菌。灭菌时先在70%～75%酒精中浸蘸10～30s，然后在0.1%溶液中浸泡生产三水醋酸钠3～10min或在1%次氯酸钠溶液中浸泡10～20min。灭菌后的处理同上。

(四)果实、种子的灭菌

这类材料有的表皮具有茸毛或蜡质。需在灭菌剂中加入几滴吐温-80，以增加灭菌效果。外植体用清水冲洗并吸干表面水分后，果实用70%～75%酒精浸泡数秒，再在2%次氯酸钠溶液中浸泡10～20min或用饱和漂白粉上清液浸泡10～30min进行灭菌。种子用10%次氯酸钠溶液浸泡20～30mjn，或用0.l%～0.2%溶液浸泡5～10min进行灭菌。灭菌后用无菌水冲洗3～5次，取出果实内部组织抗震支架重量或种子接种。

二、初代培养物的建立

外植体经过灭菌处理后，要建立起初代无菌培养材料，并使其增殖和发育，还需以下技术的配合。

（一）无菌环境

灭菌剂包装箱制作处理过的外植体只进行了表面灭菌。不能除掉所有病菌，特别是无法去除侵人组织内部的病菌。因此，有时需在培养基中加入抗生素类物质(表1-1)，防止初代培养材料的污染。但抗生素对某些种类的植物生长有抑制作用，所以，适用的抗生素种类及浓度的确定，要在实践中摸索。此外，还须保证培养基、接种器械和超净工作台无菌，并使接种室

环境保持清洁。对污染的组培材料，应灭菌后再清洗，防止真菌孢子在空气中弥漫和繁殖。

表1-1培养基中添加抗生素对防止杂菌污染的效果

车架总成

(引自曹孜义，1999)

抗生素	浓度（mg/L）	培养材料
抗生素	浓度（mg/L）	银杏	冬青	月季
链霉素	10	0	+	+
青霉素	20	+ + + + +	+ + + + +	+ + + + +
地霉素	5	0	+ + + + +	+ + + + +
夹竹桃霉素	20	+ + + + +	热风锅炉+ + + + +	+ + + + +
杆菌肽	50	+ + + + +	+ + + + +	+
新霉素	1	+	+ + + +	+