广东石油化工学院
实 验 报 告
生物技术系
专 业 生物技术
班 别 学号 姓 名
循环烘干机同组人
实验课程 大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化
实验日期 2011-6-13至2011-6-21
成 绩
大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化
一、实验目的：
1.学习并掌握大蒜SOD提取与纯化的方法及原理。
3.学习并掌握SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的方法。 4.学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活的方法。
5.熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。服装道具制作
二、实验原理：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O2-) 的歧化反应，使 O2-转化为 H2O2 和 O2。因此，SOD是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。
SOD是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3种。Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最
重要的SOD，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD，一般由两个亚基组成。SOD对热、pH以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD对及过氧化氢均敏感。SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。Cu/Zn-SOD由于氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm，由于含铜，所以在可见光680nm处有最大吸收。
国内测定SOD活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有中间产物，同时生成超氧负离子（O2-）。中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。邻苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。当有SOD存在时，由于它可催化超氧负离子(O2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。因此，可通过监测 SOD 对这个反应的抑制程度间接测定 SOD 活力。大蒜中的SOD正属于Cu/Zn-SOD。监控摄像机主板
三、实验材料
实验材料：大蒜
四、实验操作步骤
1、粗酶液制备与沉淀分离
[试剂和器材]：
(1) 材料 市售新鲜大蒜.
(2) 仪器 恒温水浴 、离心机、 布氏漏斗、抽滤瓶 烧杯、量筒、搅棒、 透析袋 、搅拌机
(3) 试剂 -18℃预冷的丙酮、磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L） [方法和步骤]
1、将蒜瓣去外膜包装内托,于搅拌机中搅拌10min后移至研钵中研磨至蒜泥状
2、SOD粗提取方法
磷酸缓冲液法：
加入3倍体积(mL/mg)的磷酸缓冲液,浸泡30~45min后用6层纱布抽滤.将滤渣再用2倍磷酸缓冲液浸泡30min后, 6层纱布抽滤.如此反复共3次,收集3次抽滤所得滤液,测酶活力.
热变性法：
将大蒜中SOD酶液于60℃热处理20min, 8 500r/min离心10min,弃沉淀,测定上清液酶活力.
3、SOD纯化沉淀分离方法
丙酮沉淀：
将酶液置于冰浴中,加入等体积经-18℃预冷的丙酮,搅拌15min,于4 500r/min离心15min,弃上清液,用聚氨酯150mmol/L磷酸缓冲液溶解其沉淀后,透析磷酸缓冲液, 4 500r/min离心10min,测定上清液的SOD酶活力。
2.离子交换层析纯化超氧化物歧化酶
[原理]
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合能力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，以液体为流动相。离子交换剂由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。结合力的大小通常由离子交换剂的选择性来衡量。
本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白，实验中选用DEAE离子交换纤维素。
[试剂和仪器]
（1）试剂
①DEAE
②缓冲液Ⅰ：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）
③缓冲液Ⅱ：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）
④0.5mol/L HCl ⑤.5mol/L NaOH ⑥馏水
（2）仪器与材料
①层析柱(1.5cm × 20cm) ②部分收集器 ③梯度洗脱仪
④紫外分光光度计 ⑤试管、烧杯、透析袋、量筒 ⑥砂芯漏斗
⑦抽滤瓶 ⑧电磁搅拌器 ⑨贮存器 ⑩混合器
[方法和步骤]
1、DEAE-纤维素的预处理：
（1）称取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯中，室温放置30min，不时轻轻搅拌。
（2）将糊状物移入3号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。如此重复，每加一次去离子水，浸泡
一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4即可（pH试纸试）。
（3）将糊状物移入烧杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不时轻轻搅拌，弃去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次。
（4）将交换剂移入3号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液pH为8.0（可用pH试纸测试）。
（5）将DEAE-纤维素浸泡在150mL酸洗缓蚀剂去离子水中。用0.5mol/L 盐酸把pH调至7.6，滴定可在pH计上进行，须使悬液最终pH在10min内无变化，然后抽滤。
（6）将上述滤块置于100毫升量筒中，加入75mL缓冲液I，慢慢搅混之后，静置20min，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH与缓冲液I几乎一致。
2、装柱
（1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。
（2）将基本平衡好的DEAE-纤维素浆液（约有1倍体积的缓冲液I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约1cm高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到高10cm以上的柱床体积。
3、平衡
当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓冲液进行平衡。流速可维持在4mL/15min，直至流出液的pH与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡8h以上或过夜。）
4、层析
用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液Ⅰ恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤2～3次，然后装入缓冲液Ⅰ，使液面高出创面2～3cm左右。
5、洗脱
（1）按图将梯度洗脱器和层析柱连接好。
（2）在洗脱瓶A（贮存器）和洗脱瓶B（混合器）内各装入100mL缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。
（3）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。
（4）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在1.5mL／min。 收集液测定蛋白质浓度和酶活性。
（5）收集合并具有SOD活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化SOD（淡蓝绿产品）。
3.SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测蛋白质的相对分子量
[原理]
SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫
键断裂，蛋白质在一定浓度的强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，是蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子的大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量。X为迁移率，k,b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
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