酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。

背景技术：

2.乙型肝炎病毒(hbv)感染是急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌的主要诱因，严重威害人类的生命和健康。目前全球大约有2.96亿人患有慢性乙肝感染，每年有150万新发感染者，2019年乙型肝炎导致约82万人死亡，2020年我国新发乙肝患者人数为90.63万人。乙型肝炎病毒可分为8个不同的基因型，即a、c、d、e、f、g、h。hbv高度的变异性与多样性决定了众多基因亚型的存在，基因亚型间序列差异至少大于4％。乙型肝炎病毒可以引起非常严重的并发症和死亡，对于慢性hbv感染，尚缺乏彻底清除病毒的治愈物，必需长期依赖于核苷类似物与干扰素类药物来降低血清hbv拷贝数。
3.酚是一种黄酮类化合物，它主要来源于姜科植物山柰的根茎，广泛存在于各种水果、蔬菜及饮料中，人们已经从茶叶、椰菜、巫榛子、蜂胶、柚子以及其他绿植物提取到它的纯品。因其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功效而受到人们的广泛关注。酚资源丰富，易于提取分离，是一种具开发潜力的药物资源，在食品和医药领域表现出很好的应用前景。
4.由于核苷类似物如拉米夫定、阿德福韦等存在着停药后反弹、耐药突变、交叉耐药等问题。而高剂量的重组干扰素也具有持续应答率低、副作用大等局限性。因此，hbv感染引起的相关疾病尚缺乏十分有效的药物与手段。

技术实现要素：

5.发明目的：本发明旨在提供一种酚的新用途，具体的提供一种酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
6.技术方案：本发明的酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
7.本发明通过实验证实，酚可显著抑制hbv dna和rna的表达量，具体的，酚可以显著影响hbv的转录过程，其在5、25μmol/l对hbv pgrna的抑制率分别为48.44％、53.59％；酚可以显著影响hbv dna的表达量。酚在1、5、25μmol/l对上清hbv dna的抑制率分别为54.09％、73.59％、94.54％。酚可以显著抑制小鼠血清中hbv dna的表达量，并且抑制率随着剂量和时间的增加而增加，酚在10、20、40mg/kg对小鼠肝脏组织hbv dna的抑制率分别为29.20％、39.58％、54.35％；酚与恩替卡韦联合用药对于hbv起到协同的作用，联合给药组对小鼠肝脏组织hbv dna的抑制率为88.30％。
8.进一步地，所述的药物为酚作为唯一活性成份或包含酚的药物组合物。
9.进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。
10.进一步地，所述的药物组合物包括酚和恩替卡韦。
11.进一步地，药物组合物中酚的含量为0.1-99wt％。
12.进一步地，酚的给药量为10-40mg/kg。
13.另一方面，本发明提供一种酚在制备慢性乙型肝炎药物中的应用。
14.本发明通过实验证实，酚可显著抑制hbv dna和rna的表达量，并随着剂量和药物作用时间的增长抑制率也随之增加。
15.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明所述的酚可用作活性成分，应用于抗慢性乙型肝炎的药物中，开拓了酚的新用途。此外，酚与恩替卡韦的联合用药对于慢性乙型肝炎起到协同作用，弥补了抗慢性乙型肝炎药物的不足之处。
附图说明
16.图1为酚给药6天和9天后hbeag的表达量；
17.图2为酚给药6天和9天后hbsag的表达量；
18.图3为酚给药6天后hbv pgrna的表达量；
19.图4为酚给药6天后hbv总rna的表达量；
20.图5为酚给药9天后hbv dna的表达量；
21.图6为酚单独给药和与恩替卡韦联合给药后hbv dna的表达量；
22.图7为酚给药后小鼠血清中hbv dna的表达量；
23.图8为酚给药后小鼠肝脏中hbv dna的表达量；
24.图9为酚给药后小鼠肝组织h&e染检测hbcag的表达量。
具体实施方式
25.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
26.实施例1
27.hepg2.2.15细胞培养：
28.hepg2.2.15细胞系用10％胎牛血清，青霉素100iu/ml及链霉素100ug/ml，g418 400μg/ml的dmem培养基培养，37℃，5％co2的条件下培养。
29.酚对hepg2.2.15细胞毒性：
30.hepg2.2.15细胞按1
×
103个/孔浓度接种到96孔板中置37℃，5％co2培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，将细胞用pbs洗2次，分别加入含不同浓度(6.25、12.5、25、50、100、200、400μmol/l)酚的100μl细胞维持液，实验设置正常细胞对照组，每个浓度设置3个复孔。hepg2.2.15细胞于37℃培养9天，每三天换新鲜给药培养基，每日观察细胞状态。最后采用cck8法测定细胞活力，每孔加入cck8 10μl，避光放置30min，在450nm处检测其吸光度。实验共重复3次，计算细胞毒性。
31.细胞存活％＝(实验组-空白组)/(对照组-空白组)
×
100％
32.表1酚对hepg2.2.15的细胞毒性
[0033][0034]
实施例2
[0035]
酚对hbv抗原分泌的抑制作用
[0036]
hepg2.2.15细胞按5
×
104个/孔浓度接种到24孔板中，置37℃、5％co2培养箱中培养过夜。将含有不同浓度酚的dmem培养基维持液加入hepg2.2.15细胞中，使得孔中药物终浓度为1、5、25μmol/l。实验还设有不加药的正常细胞对照组以及阳恩替卡韦组。组将细胞置37℃、5％co2培养箱中培养。每隔72h，收集培养上清至1.5ml ep管内，置于-20℃冰箱保存。用elisa试剂盒检测酚处理hepg2.2.15细胞6天、9天的hbv抗原分泌的量。
[0037]
结果见附图1，2，酚对hbeag及hbsag都存在抑制作用，并随着剂量和药物作用时间的增长抑制率也随之增加。
[0038]
实施例3
[0039]
酚对hbv rna的抑制作用
[0040]
hepg2.2.15细胞核5
×
104个/孔浓度接种到24孔板中，置37℃、5％co2培养箱中培养过夜。将含不同浓度酚的dmem培养基维持液加入hepg2.2.15细胞中，使得孔中药物终浓度为1、5、25μmol/l。实验还设有不加药的正常细胞对照组以及阳恩替卡韦组。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养。每3天换一次新鲜的含药培养基，6天后利用trizol法提取胞内rna。qrt-pcr检测酚对胞内hbv相关rna的转录影响。
[0041]
附图3实验结果表明酚可以显著影响hbv的转录过程，发现其在5、25μmol/l对hbv pgrna的抑制率分别为48.44％、53.59％。附图4实验结果表明酚对hbv总rna的抑制效果较好，在5、25μmol/l对hbv mrna的抑制率分别为56.67％、73.90％。综上结果表明酚在25μmol/l对hbv rna的抑制率都高达50％，说明其可以显著性抑制hbv相关rna的转录，且存在剂量依赖性关系。
[0042]
实施例4
[0043]
酚对hbv相关dna的抑制作用
[0044]
hepg2.2.15细胞核1
×
105个/孔浓度接种到12孔板中，置37℃、5％co2培养箱中培养过夜。将含不同浓度酚的dmem培养基维持液加入hepg2.2.15细胞中，使得孔中药物终浓度为1、5、25μmol/l。实验还设有不加药的正常细胞对照组以及阳恩替卡韦组。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养。每3天换一次新鲜的含药培养基，9天后用qiaamp dna blood mini kit检测试剂盒提取培养上清中hbv dna，qrt-pcr检测hbv dna的表达量。
[0045]
附图5实验结果表明酚可以显著影响hbv dna的表达量。酚在1、5、25μmol/l对上清hbv dna的抑制率分别为54.09％、73.59％、94.54％。表明酚对上清hbv dna抑制存在剂量依赖关系。附图6实验结果表明酚与恩替卡韦联合给药对上清hbv dna抑制起到协同作用。
[0046]
实施例5
[0047]
酚在动物水平对hbv的抑制作用
[0048]
将10μg paav-hbv1.2质粒通过高压尾静脉注射到c57bl/6小鼠体内，随机分成7组(空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、联合给药、组阳组)，每组6只小鼠。通过灌胃给与相应的药物，空白组不做任何处理，模型组给与同体积的pbs。每4天小鼠眼静脉取血，第20天解剖小鼠取肝脏组织。qiaamp dna blood mini kit检测试剂盒提取血清中hbv dna，qrt-pcr检测hbv dna的表达量。
[0049]
附图7实验结果表明酚可以显著抑制小鼠血清中hbv dna的表达量，并且抑制率随着剂量和时间的增加而增加。酚和恩替卡韦的联合给药与体外实验结果一致起到协同作用。附图8实验结果表明酚可以显著抑制小鼠肝脏组织中hbv dna的表达量。酚在10、20、40mg/kg对小鼠肝脏组织hbv dna的抑制率分别为29.20％、39.58％、54.35％。联合给药组对小鼠肝脏组织hbv dna的抑制率为88.30％。附图9免疫组化结果表明酚给药组和联合给药组小鼠肝脏组织中hbcag阳性细胞数显著减少，且联合给药组比阳组抑制效果更好。
[0050]
以上结果表明酚可以显著抑制hbv感染的体内和体外模型中hbv的复制。

技术特征：

1.酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。2.根据权利要求1所述的酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物为酚作为唯一活性成份或包含酚的药物组合物。3.根据权利要求1所述的酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。4.根据权利要求2所述的酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括酚和恩替卡韦。5.根据权利要求3所述的酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，药物组合物中酚的含量为0.1-99wt％。6.根据权利要求3所述的酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，酚的给药量为10-40mg/kg。7.酚在制备慢性乙型肝炎药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。由于核苷类似物如拉米夫定、阿德福韦等存在着停药后反弹、耐药突变、交叉耐药等问题。而高剂量的重组干扰素也具有持续应答率低、副作用大等局限性。因此，HBV感染引起的相关疾病尚缺乏十分有效的药物与手段。本发明的酚可用作活性成分，应用于抗慢性乙型肝炎的药物中，开拓了酚的新用途。此外，酚与恩替卡韦的联合用药对于慢性乙型肝炎起到协同作用，弥补了抗慢性乙型肝炎药物的不足之处。性乙型肝炎药物的不足之处。