课题名称： 紫杉醇发酵产品的可行性报告
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紫杉醇发酵产品可行性报告电厂生产管理系统
摘要：紫杉醇是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一，在临床上广泛应用，但受原料红豆杉木短缺的制约，存在巨大的供需差距。目前，人们主要进行的是从红豆杉树中提取、分离和纯化紫杉醇的研究。然而研究表明红豆杉各个部位的紫杉醇含量均甚微，且红豆杉树又是生长缓慢、散生、濒危的珍惜保护植物。本文研究了微生物（内生真菌）发酵法在紫杉醇现代生产中的应用（包括内生真菌的分离纯化，紫杉醇的制取），该方法有效地为产生紫杉醇药物开辟了新的途径，其应用前景十分广阔；而且对于植物来源的天然药物的新生产途径的开发及濒危药用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益。 关键词：紫杉醇，微生物发酵，内生真菌，分离纯化
一、 紫杉醇的研究意义：
紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxo1)是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一[1] 。紫杉醇最早是Wani等[2]于1971年从短枝红豆杉(Taxusbreviifolia)树皮中分离得到的。随后，Schif等[3]证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtubules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(LPS)的作用，可调节机体的免疫功能[4]。目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破钢筋剥肋滚丝机[5]。为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。
二、目前生产紫杉醇的几种主要方法：
紫杉醇的生产方法主要是提取分离和化学合成，提取分离的方法按来源不同又可分为三大
类：从植物中分离提取、从真菌中分离提取及从培养细胞中分离提取．
1． 化学合成法
化学合成是生产药物的一条重要途径，许多天然药物(如一些抗生素)除了可从生物体内提取外，还可通过化学的方法合成．紫杉醇的药效被发现以来，其化学合成的方法一直受到重视并得到很多的研究探索．迄今为止，在生产上有价值的紫杉醇的全合成尚未取得成功．紫杉醇的半合成法的问题主要在于：(1)合成原料在植物中含量不高，提取分离成本较高．(2)每一步反应得率低，而且有时会碰到选择性较差的问题．所以，无论是全合成还是半合成，即使目前都取得了成功，但都难以应用于大规模的工业化生产．
2.直接从红豆杉科植物中分离提取
紫杉醇含量与种、部位、生长年限、生长环境等因素有关．在所有红豆杉中短叶红豆杉中紫杉醇含量最高；从生长时间上看，生长时间越长的器官或组织紫杉醇含量越高；从生长环境上看，生长在阴处的树皮比暴露在日光下的高；就部位来看，一般树皮中紫杉醇含量较高，短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量可达0．069 ．据估算，从2 000～3 000棵稀有的紫杉
树皮中只能提取1kg紫杉醇，而对1例病人制备充足的药物需3～4棵百年的老红豆杉树[6]．自紫杉醇药效发现以来，红豆杉资源遭到毁灭性开发，有些种系濒临灭绝．
3 利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇
大规模地培养微生物细胞实现了许多种抗生素的大量生产，极好地满足了病人对抗生素的需求，挽救了无数人的生命．抗生素是微生物的次生代谢产物，紫杉醇是植物细胞的次生代谢产物，能否通过大规模的植物细胞培养大量获取紫杉醇很有研究价值。目前未能实现工业化生产，这主要是因为：植物细胞生长慢，紫杉醇含量低，使得单位时间单位质量细胞紫杉醇含量较低，即使在理论上工业化生产也不能取得经济效益。
4 从紫杉醇内生真菌中发酵制取
与过去从红豆杉植物的树皮中提取紫杉醇相比，内生真菌生产紫杉醇具有更大的优势，真菌不仅能在简单的培养基上良好生长，产生大量的发酵产物，发酵周期短，还可以在生物反应器中人为控制各种参数，并可通过诱变育种等手段来提高菌种性能以提高紫杉醇产量，所以大规模工业生产容易实现，其应用前景十分广阔；而且对于植物来源的天然药物
的新生产途径的开发及濒危药用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益，这样就为无限而有效地产生紫杉醇药物开辟了新的途径。
mesh设备利用微生物发酵生产紫杉醇的优点:无论是从生态还是经济条件的角度来看，利用植物内生真菌作为药源是一项不会枯竭的资源，微生物发酵的方法具有以下优点：（1）微生物作为工业生产的源泉，可以在发酵罐中进行，可以源源不尽的进行生产；（2）微生物发酵的方法容易扩大化，利于工业化生产；（3）微生物的生长仅仅需要一般的培养技术，在收集紫杉醇之前，可以通过改善培养环境、改进技术来提高产量；（4）微生物易于通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量；（5）内生真菌生长迅速，易于培养，应用的培养基相对比较便宜；（6）可望满足市场的需求，降低紫杉醇的价格。植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，用微生物发酵的方法生产紫杉醇，是解决药源问题的有效途径。
三、紫杉醇的生产工艺
1.内生真菌分离：
从植物体内分离内生真菌的关键一步是对植物组织表面进行消毒，以控制表生真菌的生长，使内生真菌得以分离。目前常用次氯酸钠作为消毒剂[7]，其分离方法是先用水冲洗植物材料，然后在75％ 乙醇中浸泡50s后，在4％次氯酸钠水溶液浸泡0．5h，然后在75％酒精中再浸泡30s，最后用无菌水冲洗。一般分离所用的培养基为PDA培养基。为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素，如链霉素、四环素等。一般2O℃ ～25~℃培养一个月左右，即可形成内生真菌菌落。
2.发酵培养:
从PDA平板上切取5 mm×5 mm小块菌落，接种至装有150 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，于28℃ ，100 r／min摇床上振荡培养10~14 d。
3.紫杉醇的提取分离：
真菌培养物首先要进行预处理，然后进行紫杉醇的提取。主要提取方法是用有机溶剂萃取。马天有等[8]的方法是，将培养物冷冻后用转速为lO000r／min组织捣碎机匀浆3min，用4层纱布过滤，滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(10：1,V／V)，充分振荡后静置8
h～12h，收集有机溶液相，并在45℃条件下减压蒸发，残留物溶于1mL甲醇中作为样品溶液备用。周东坡等人[9]对发酵产物萃取的方法是：收集培养物先经3 O00r／min离心15min，并将沉淀物捣碎后重新与上清液混合，再经3500r／min离心12min，保留上清液，用等体积的氯仿与甲醇混合液(10：1， V／V)萃取，收集有机相后置3O℃ 下鼓风干燥，将蒸发后的萃取物溶于少量的氯仿中保存。后来又进行了改进，即发酵液过滤后，滤渣烘干(低于5O℃)装配式隔墙板，滤液称量体积。滤渣用适量乙酸乙酯萃取，滤液用1／2滤液体积的乙酸乙酯萃取(30min)，下层水层再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯，减压蒸馏。用适量甲醇洗涤减压蒸馏得到的固体，再用正己烷洗涤15min，收集下层甲醇，加入乙酸乙酯和水(1：1，)进行萃取(30min)，将收集的乙酸乙酯进行减压蒸馏，用一定量的乙腈洗下固体，O~C密封保存，优点是能够充分萃取出发酵液和菌丝中的紫杉醇。陈建华等人[10]的萃取方法比较简单，直接用菌丝进行，取菌丝1g均质5min后用甲醇抽提，将抽提液通过离心，收集上层，用旋转蒸发器蒸干，加入等体积水和二氯甲烷抽提，弃水相收集有机相，再次蒸干，所得粉末溶于少量甲醇中，用粒径为0．15 m～0．18ttm的硅胶粒子作填料的硅胶柱进一步纯化。综上所述，在分离真菌发酵液中的紫杉醇首先要考虑预处理，然后用相应的萃取方法进行分离，要考虑萃取液的种类和减压蒸馏的温度。
4.紫杉醇的纯化：
防盗螺母
得到较高纯度的紫杉醇十分重要。紫杉醇的纯化多采用谱法。已报道的用于紫杉醇分离的方法除薄层谱法、柱层析法外还有胶束电动毛细管谱法、高速逆流谱法、树脂吸附分离法、膜分离法、沉淀法、化学反应法和药理作用靶点法[11]。粗分离的紫杉醇一般采用柱层析纯化。周东坡[12](1995)报道，用高20cm层析柱，以硅胶(60目～100目)为吸附剂纯化紫杉醇。将一定量的氯仿加入萃取物中，然后加样入柱，先用氯仿洗脱再用乙腈洗脱。庞欣[13]采用苯基柱固相萃(SPE)与高效液相谱(HPLC)联用来纯化紫杉醇。经SPE处理的样品最大吸收峰的峰高明显降低，杂质峰大大减少。真菌发酵产物的提取物中杂质较多，常规精制方法使用大量溶剂，而且处理过程中乳状液的生成也会造成样品的损失，导致样品的回收率不够理想，该法克服了上述缺点，是目前解决微生物发酵产物杂质多、产量低的较好方案。金涛等[14]探索了对紫杉醇产生菌发酵液有效脱作用同时制备高纯度紫杉醇的树脂及层析条件。他采用了7种树脂对紫杉醇产生菌发酵液进行脱和提取，结果表明201×4型树脂处理样品的效果最好，利用80％ 的乙腈水溶液洗脱，紫杉醇的回收率达到了98.8％ 。从而为提取紫杉醇提供了一种操作简单、回收率高、污染较低的树脂层析方法。
5.紫杉醇含量测定：
真菌发酵液中紫杉醇的定量可采用薄层谱(TLC)、高效液相谱(HPLC)、UV免疫分析、生物学方法和放射性前体标记等。另外还有竞争抑制酶免疫分析法，它是利用对紫杉醇有专一特性的单抗进行测定，此方法简单易行且灵敏度高。HPLC是最常用的、较为有效的分析检测方法。HPLC不仅可以测定紫杉醇含量，而且还能追踪分离紫杉醇。
四、内生真菌的分离筛选：
1.内生菌种的分离
内生真菌的分离可以采取两种方法：一种是，采用标准的真菌分离纯化的方法［15,16］。取植物组织，用70%的酒精将其表面消毒，然后用灭菌的刀片将外层组织削去，将内部组织削成小片，小心置入水琼脂培养基中，待菌丝长成后，挑取不同菌丝末端置于PDA培养基中，观察生长情况。另外一种方法———平板灌注法［17］。用灭菌的刀片去除外皮层和木质部，用70%的酒精消毒，无菌水冲洗，将红豆杉样品加入到适量的无菌水中，放入研钵中充分研磨，取匀浆注入融化的的PDA培养基中，摇匀，倒平板，25℃培养。内生真
菌一般在PDA或MID培养基中不形成孢子，或者是在灭菌的寄主茎叶中也不形成孢子。然而，这些真菌可以在康乃馨的叶片上形成孢子。康乃馨叶片经过γ射线照射后，置于水琼脂培养基中，将分离得到的内生真菌接种到康乃馨叶片上，23℃下培养1~2 个星期后，在康乃馨叶片上形成暗的子实体结构，对于真菌的鉴定具有重要的作用。研究人员已经将小孢拟盘多毛孢的有性阶段研究清楚［18］。内生真菌可以在15%的甘油中—70℃保存［16,19双极化高频头］。
2.内生菌种的纯化
待PDA培养基初步长出菌落时，选择长势较好的菌落，切取5 mm×5 mm小块单菌落接种另一PDA平板，28℃培养3～4 d．
3.冷冻保存
从PDA平板上选择长势良好且未染杂菌的菌落，切取3～4小块菌体，放入灭菌后装有1 mL液体石蜡的塑料管中，置于4℃冰箱保存．本次实验共分离纯化并保存了147株菌种．当重新培养菌种时，只需从石蜡管中取出一小块菌体贴于PDA平板上即可活化．
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