SPR技术用于BSA-antiBSA动力学研究
一． 实验目的
1. 了解SPR技术的原理和应用。
2. 掌握SPR技术进行动力学研究的基本步骤。
二． 实验原理
SPR的全称是表面等离子体激元共振 (surface plasmon resonance, SPR)是一种检测金属表面超薄吸附层厚度和结构变化的物理光学技术，是研究生物分子与其它分子相互作用的有力工具，具有高灵敏、免标记、实时检测等优点，在研究分子之间作用的动力学方面具有独特的优势。 SPR技术通常用稳定性好并且折射率高的金膜做感应芯片，当感应芯片表面发生分子的吸附和相互结合状况发生变化时，金属表面折射率的灵敏变化就可以很便利地研究生物分子间的相互作用。对于生物分子的检测，通常在金膜表面修饰上生物膜基底以防止生物分子直接接触金膜发生变性或非特异性吸附。
BSA（牛血清蛋白）是一种比较稳定的蛋白，在生化实验中有广泛的应用。它对应的抗体是anti-BSA，二者分子量都比较大，并且之间的作用很强。当芯片表面固定了BSA后，anti-BSA与BSA的结合会引起表面折射率的明显变化，通过SPR信号反映出来。不同浓度的anti-BSA样品对应不同的SPR信号响应。把不同浓度的信号曲线放在一起用动力学软件拟合就可以得到动力学数据和热力学数据。
预先修饰的生物膜表面有羧基，通过活化剂活化了表面羧基后，含氨基的BSA分子就会直接与活化后的羧基相互作用，从而被固定在芯片表面作为捕获分子。Anti-BSA分子作为靶点分子再与BSA相互作用而被结合到表面，引起SPR信号的变化。结合到表面的Anti-BSA分子还可以通过NaOH溶液使芯片再生，重复使用。NaOH溶液可以破坏BSA和Anti-BSA分子之间的作用，使之解离。
三． 主要仪器和试剂
1. SPR检测仪器。
2. 磷酸盐缓冲液（PBS）： 10 mM K2HPO4，10 mM KH2PO4 ，10 mM NaCl，pH 7.2制鞋
3. EDC：0.4 M，用水溶解，使用之前新鲜配制。
4. NHS:0.1 M，用水溶解，使用之前新鲜配制。
5. BSA 溶液： 1 μM，用PBS溶解并稀释。
6. anti-BSA 溶液：33.4，66.8移动门，133.6, 334.0 nM，用PBS溶解并稀释。
7. 氨基乙醇溶液：1.0 M，pH 8.0。先溶于二次水，再用NaOH溶液调节pH值。
8. NaOH溶液：10 mM环二肽。
四． 实验步骤
先在金膜表面修饰一层聚乙二醇生物膜(PEG)，储存备用。把制备好的PEG修饰芯片放在SPR检测仪器上面，在表面流动缓冲液PBS。当基线稳定后，溶解并混合EDC和NHS大圆针织机溶液，在单一流动通道内，注射混合液，活化芯片表面的羧基8-10 min。活化结束基线稳定后，再注射BSA溶液。然后，再注射氨基乙醇溶液来封闭未被反应的羧基。封闭结束后，采用环流模式，注射33.4 nM 的anti-BSA溶液，使溶液从一个通道流入另外一个通道，其 中未被固定BSA的通道是空白试验通道。反应实验通道与空白实验通道相减后的差值用于模拟动力学。第一个浓度做完之后，注射NaOH再生液，使芯片再生，然后再依次注射不同浓度的anti-BSA和NaOH连续供墨打印机再生液。最后把所有浓度曲线一起拟合即可得到动力学数据。
五． 思考题
1. 为什么缓冲液的pH值要维持在盐酸环丙沙星凝胶7.4左右？如果太低或太高会有什么影响？
2. 为什么要用氨基乙醇封闭表面？如果不封闭会有什么影响？
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