周名兵;胡盼;龚梅;黄棣;杜晶晶;张利;李玉宝
【摘 要】节能转轮除湿机1-ethyl-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride（EDC.HCl） and sodium tripolyphosphate（STPP） as the covalent and ionic bi-crosslinking agents were introduced to prepare gelatin-chitosan（gel-CS） composite porous scaffolds.The structure and morphology of the scaffolds were characterized by Fourier transform infrared spectrometer（FT-IR） and scanning electron microscope（SEM）,and also the porosity,mean pore size,swelling properties and degradation were studied.In addition,the cross-linking mechanism was analyzed.The results show that covalent and ionic cross-linkage have taken place between the two phases of gel and CS in the composite porous scaffolds;these scaffolds have interconnected pores and high porosity,and the mean pore size is in the range of 136.1-182.9μm;the swelling properties of the scaffolds prepared by covalent and ionic bi-crosslinking are better than that of single covalent cross-linking,indicating that the cross-linking degree of covalent and ionic bi-crosslinking is higher
异位发酵床than that of single covalent cross-linking.The degradation experiments show that,if STPP is constant,the degradation properties of scaffolds become better with EDC increasing;if EDC is constant,0.5% STPP can produce the scaffold with the best degradation property.%采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（EDC.HCl）和三聚磷酸钠（STPP）作为共价-离子双交联剂交联制备了明胶-壳聚糖（gel-CS）复合人工真皮支架。通过FT-IR和SEM对复合多孔支架结构及形貌进行表征,同时对复合多孔支架的孔隙率、平均孔径、溶胀性能和降解性能进行了研究。研究结果表明,明胶和壳聚糖两相间成功地发生了交联反应,形成了具有贯通孔结构和良好孔隙率的复合多孔支架。该支架平均孔径在136.1～182.9μm之间,且随着壳聚糖含量的增加,孔径及孔隙率随之降低;溶胀性能研究发现,相较于单一共价交联方法,采用双交联法制备的支架溶胀率有所降低,再次印证双交联法制备的支架其交联度较单一共价交联的高;酶降解实验表明,固定STPP含量,随着EDC含量增加,复合支架的降解性能越好,而EDC含量一定,则STPP含量为0.5%时,复合支架具有最好的降解性能。
【期刊名称】《功能材料》
【年(卷),期】2012(043)011
【总页数】5页(P1465-1468,1471)
【关键词】明胶;壳聚糖;共价-离子交联;多孔支架
【作 者】金属表面涂料周名兵;胡盼;龚梅;黄棣;杜晶晶;张利;李玉宝
【作者单位】四川大学纳米生物材料研究中心,分析测试中心,四川成都610064;四川大学纳米生物材料研究中心,分析测试中心,四川成都610064;四川大学纳米生物材料研究中心,分析测试中心,四川成都610064;四川大学纳米生物材料研究中心,分析测试中心,四川成都610064;四川大学纳米生物材料研究中心,分析测试中心,四川成都610064;四川大学纳米生物材料研究中心,分析测试中心,四川成都610064;四川大学纳米生物材料研究中心,分析测试中心,四川成都610064
【正文语种】中 文
【中图分类】TB332
明胶-壳聚糖支架是多糖-蛋白体系的一种。目前，多糖-蛋白体系已广泛应用于人工皮肤、
肺、软骨、骨等组织工程领域，具有很高的研究价值［1-5］。明胶(gel)是胶原蛋白的衍生物，其既保留了可与胶原相媲美的生物学性能(如可生物降解，无毒性)，又无抗原性，因此，在生物医学领域应用非常广泛［6］。壳聚糖(CS)是甲壳素的脱乙酰化产物，是自然界中迄今发现的唯一的天然阳离子多糖，与细胞外基质中的糖胺聚糖具有类似的结构［7］。壳聚糖具有良好的生物降解性、生物相容性及力学性能，加之其独特的促进伤口愈合和抗菌等性能，故成为近年来倍受关注的一种医用生物材料，且部分商品已用于临床。相较于壳聚糖，多孔明胶支架则具有高溶胀性、易变形、脆性大、降解速率过快等问题［8，9］。基于此，在明胶中掺入少量壳聚糖以改善其力学性能，降低溶胀率，延长其降解时间，避免新生组织尚未长好支架就已完全降解。
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)是一种水溶性的碳化二亚胺，常用于羧基(—COOH)和胺基(—NH2)的缩合反应。对于多糖-蛋白体系来说，这是一种常用的共价键交联剂，而且没有明显的毒副作用。三聚磷酸钠(STPP)是一种离子交联剂，通过其聚阴离子基团与离子化的氨基(—NH+3)发生交联，从而可使多肽-蛋白体系达到离子交联效果。有研究报道，共价交联的交联效率较离子交联高，因而赋予材料更好的力学性能，但离子交联在提高材料的溶胀性能和载药负载及药物控释方面具有较大优势［10］。为获得
压花模具
力学性能良好且在水溶液中能保持较高溶胀能力，同时进一步扩展高水溶物的负载及释放，本文采用共价-离子双交联剂交联gel-CS复合多孔支架，以探讨该交联体系的交联机理及对复合支架性能的影响。
本文采用水溶性的明胶和壳聚糖盐酸盐为原料，通过冷冻干燥法制备gel-CS复合多孔支架，再先后使用EDC·HCl和STPP对其交联。研究不同组分比例及不同交联条件对gel-CS复合多孔支架结构及性能的影响，以得到一种综合性能优良的人工真皮组织工程支架。
应用集成明胶(gel≥250 Blooms)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N－羟基琥珀酸亚胺(NHS)，阿拉丁试剂(上海)有限公司;壳聚糖盐酸盐(CS)(脱乙酰度 ≥90%)，浙江奥兴生物有限公司;丙酮、三聚磷酸钠(STPP)、乙醇，成都科龙试剂公司。胶原酶Ⅰ(CollagenaseⅠ)，Gibco。
称取适量的明胶，加入去离子水中于37℃下磁力搅拌，直至完全溶解，配制成明胶水溶液。再称取水溶性壳聚糖盐酸盐直接溶于水中配制成浓度分别为1%、2%、3%和4%(质量分数)的壳聚糖溶液，并按照明胶/壳聚糖体积比为 9∶1、9∶2、9∶3、9∶4 的比例配制成1%(质量分数)的gel-CS混合溶液，再通过磁力搅拌充分混匀，然后倒入预冻好的培养皿中，
置于－70℃冰箱中冷冻12h，再于－50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24h，制得复合多孔支架。
将所得多孔支架浸入含有EDC/NHS体系(V(EDC)/V(NHS)=4/1)的 V(丙酮)/V(水)(9∶1)混合液中，置于37℃摇床中反应24h。反应结束后用去离子水洗涤3次，每次10min，然后置于pH值=5的STPP水溶液中于4℃反应2h，再用去离子水洗涤3次，每次10min。最后，将复合多孔支架冷冻干燥并保存于干燥器中备用。
采用美国Nicolet公司Nexus 670型傅立叶变换红外光谱仪对样品进行分析;采用日本Jeol公司的JSM 6510LV型扫描电镜(SEM)对复合多孔支架形貌进行观察;采用ImageJ软件对复合多孔支架的平均孔径进行计算。
将体积为V1的无水乙醇加入一带有刻度的试管中，将切割成合适大小的支架样品浸入其中3min，接负压吸引脱气，使乙醇充盈于多孔支架的孔隙中，至无气泡逸出，记录此时乙醇体积(浸没支架)为V2。取出浸满了乙醇的样品，剩余的乙醇体积记为V3。按式(1)计算支架的孔隙率:
文摘卡以上每组各做3个平行实验，求其平均值。
切取约1cm×1cm的复合支架，称重记为W0。然后浸于37℃的磷酸缓冲液中10min取出，用滤纸吸干表面的水分称重W。溶胀率按式(2)计算:
以上每组各做3个平行实验，求其平均值。
称取1cm×1cm质量为W0的复合支架，置于含60μg/mL胶原酶的PBS溶液中(pH 值=7.4)，37℃水浴中振荡。一定时间后取出，二蒸水清洗3次，冷冻干燥后称重，记为Wt，质量残余率如式(3)所示:
EDC/NHS双交联剂体系中，EDC可使—NH2基团和—COOH基团间发生共价交联，从而达到两相间的交联效果，而NHS则通过形成稳定的活泼酯中间体而增强碳二亚胺交联产物的稳定性。EDC只是使—NH2和—COOH基团之间形成酰胺键，而本身并没有成为交联产物的一部分。EDC首先和羧基耦合形成一个O—异酰基脲结构，这一活化中间物受到—NH2基团进攻形成酰胺交联，同时该活化中间物可以消除并被清洗掉［11］。EDC交联剂具有无毒、生物相容性良好的特点，用其交联的胶原基支架常表现出更为优异的细胞相容性，因此该类交联剂得到各国研究者的广泛关注。STPP水解后释放出钠离子，生成带阴离子的三聚磷酸根基团，其与带正电荷的—NH+3之间会发生静电吸附，从而发生交联，而
且其交联结构为空间立体状。STPP水解过程中会产生OH－而使水解溶液呈碱性，这样就会中和一部分—NH+3，所以在反应前应将STPP溶液的pH值调至5左右。当STPP溶液的pH值较低时，就会预先中和掉STPP水解产生的OH－，此时gel和CS上残余的—NH2离子化，形成—NH+3，这样STPP才能与gel-CS复合支架发生离子交联反应。其反应示意图如图1所示。
未交联、EDC单交联、EDC和STPP双交联的gel-CS(9∶1)复合真皮支架的红外光谱如图2所示。
从图2(a)可以看出，3415cm－1处的吸收峰为壳聚糖中O—H和N—H的伸缩振动峰与明胶中N—H伸缩振动峰的叠加峰，1653和1541cm－1处则为酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的特征峰。图2(b)中，位于1654和1549cm－1处的两个酰胺峰较图2(a)中有所增强且发生了蓝移，说明产生了新的酰胺键。可能是EDC/NHS双交联剂体系使壳聚糖的—NH2与明胶的—COOH以及明胶自身的—NH2与—COOH之间发生了缩合反应。此外，在870～1000和700cm－1左右出现了—P—O—P—的两个特征吸收峰。从图2(c)可以发现存在896和705cm－1两个峰;PO 键在1205～1310cm－1处有特征峰，同样从图2(c)中可以发现1274cm－1峰;所以表明STPP使壳聚糖和明胶发生了交联反应。
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