微图案化聚乳酸薄膜制备实验
09级 常剑
实验原理：
在相同的作用浓度下杆菌肽对金黄葡萄球菌的抑菌效果更显著。采用碳化二亚胺(EDC-NHS)两步接枝法。
实验材料：
聚（乳酸—羟基乙酸）PLGA 75/25，过氧化氢，EDC（碳化二亚胺），NHS（N-羟基丁二酰亚胺），MES（2-甲基吗啉代-乙磺酸），MAA（一甲基丙烯酸），杆菌肽(10mg/ml)，琼脂糖，二氯甲烷，巯基乙醇
金黄葡萄球菌（最低抑菌浓度为0.0325 mg/mL）
聚四氟乙烯 六孔板两个 镊子 三蒸水 烧杯等
用过氧化氢清洗干净的玻璃片，铜片，牛津杯
试剂配方：
MES缓冲液光敏三极管 MES:1.156g NaCL:1.146g 50ml
净烟器
EDC 0.04g NHS:0.11g溶于10mlMES缓冲液中
牛肉膏蛋白胨细菌培养基（BPY）：蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、琼脂15-20 g、蒸馏水1,000 mL，pH 7.0-7.2，0.11 Mpa 121 ℃灭菌20 min。
MTT溶液：称量0.5 g固体MTT，溶于100 mL的PBS中，配制成5 mg/mL，0.22 um微孔滤膜过滤除菌，分装至1.5 mL离心管中，-20 ℃避光保存。 PBS缓冲液（称取分析纯NaCl8g,Kcl0.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KH2PO40.2g,溶于1000ml三次蒸馏水中调PH为7.4。高压灭菌）
实验步骤：
（一）薄膜图案化
1、配制0.8%取样装置琼脂糖溶液：称取0.4g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50ml蒸馏水，加热溶化。 2、取一平皿，倒入0.8%琼脂糖溶液，待其凝固，在凝胶上盖上聚四氟乙烯塑料薄膜。
3、称量PLGA颗粒1g溶于10 ml的之中，过夜溶解完全。
4柔翼无人机、滴膜：在每个与24孔板孔径大小相当的小玻璃圆片上滴加0.1 ml成膜，使膜覆盖住玻璃片。
5、干燥：在通风橱中干燥24h，再于真空干燥箱中50℃干燥24h，再在超声波中清洗。
6、采用衰减全反射傅立叶转换红外（ATR-FTIR）光谱扫描技术对所制备的膜表面的基团进行表征分析，以确定PLGA薄膜表面游离羧基的存在。 7、取两片聚乳酸薄膜放于培养皿中，在膜上如图放置铜片，玻璃片，牛津杯。
8、在培养皿中加入30%过氧化氢溶液。在254nm紫外光下照30min。
9、用吸管吸出过氧化氢，并用三蒸水冲洗。
10、用吸管将5v%的一甲基丙烯酸（MAA）加入培养皿，紫外光照射1.5h，室温进行。
11、重复8,9,10步骤。与只处理一次，做个对照组。（多做几次是否能提高接枝羧基的数量）
全桥整流
12、三蒸水冲洗。
13、取新的六孔板，吸取2ml溶有EDC/NHS的MES缓冲液加入六孔板的一个孔中。
14、用镊子取图案化PLGA膜放入上述加过MES的孔中，活化15-20min。活化时确保PLGA膜完全侵泡在溶液中。
15、用吸管吸弃活化后的缓冲液，用MES洗涤2-3次，完全去除残余的EDC/NHS.
16、吸取1mlMES重新加入洗涤后的孔中，然后加1ml杆菌肽溶液，反应2h。反应时确保PLGA膜完全侵泡在溶液中。反应过程中盖好盖子防止落入灰尘等。
17、用吸管弃除反应后的溶液，用三蒸水反复冲洗，以洗去残留的杆菌肽溶液。洗后也可以超声1min。在超净台吹干膜。
18、待进行荧光氨检验和抗菌检验。
（二）抗细菌检测
1、接种
在超净工作台中，在牛肉膏蛋白胨细菌营养培养基上接种金黄葡萄球菌。
2、培养
触摸白板 在37℃细菌培养箱中培养24h.
3、制备菌悬液
在试管培养基斜面上加入10ml灭菌的生理盐水,振荡摇匀，在显微镜下用细胞计数板计数，稀释将最终的菌悬液制成107 个/ml。
4、浸入细菌
将样品膜、对照膜放入24孔板中，再分别加入新制的金黄葡萄球菌菌悬液。
5、培养
接种后的24孔板放入37℃的细菌培养箱中，培养24h。
6、加MTT
在受试的24板中加入20ulMTT，细菌培养箱中培养4h。
7、拍照
终止培养，小心将膜从孔中取出，用大量PBS缓冲液冲洗，再在倒置显微镜下观察并拍照。
注意事项：1、EDC/NHS溶液现配现用。
2、，MAA有毒需在通风橱进行。
3、MAA没有洗净，易出现发白。超声波清洗易膜脱落。
4、挥发时，必须放入狭小空间使其慢慢挥发，防止膜出现气泡发白。
5、二氯甲烷比挥发快，用三氯合适，防止发白。
6、长时间放置易分解。
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