李腾达;刘鹏;龙曙萍;刘云;黄元兰;张薇薇;郭杰;谷明莉;邓安梅
【摘 要】Objective To examine the expression of CD93 in serous exosomes from patients with cryptococcal meningitis,fur-ther explore its clinical significance.Methods The 38 experimental serum samples were from patients who received the diag-nosis with cryptococcal meningitis in Changhai Hospital and Changzheng Hospital in Shanghai from November 2012 to De-cember 2016.The diagnosis standardization was that the cerebrospinal fluid dyeing was positive or the culturing was posi-tive.The 38 controls were collected from the health individuals examined at the same time.The exosomes in serum was sepa-rated by the ultracentrifuge method.Magnetic bead-capture combined with the flow cytometry method was used to identify antigens on the surface of exosomes.The protein level of cytokines in serum was quantified by ELISA method.The compari-son of tested values from experimental and controlled groups was measured by two independent samples't test,and the cor-relation between two variates was showed by Pearson coefficient.
Results The results of flow cytometry showed that the ex-pression of CD93 on exosomes in the serum samples from experimental group was higher than that in the controlled group, which was(79.11±19.31 vs 23.98±6.56)%,with difference in statistics(t=16.66,P<0.000 1).The expression levels of IFN-γin serum samplefrom experimental and control groups were(39.78±10.77 vs 58.98±16.99)pg/ml,with differ-ence in statistics(t=5.884,P<0.000 1).The expression levels of IL-17 in serum sample from experimental and control groups were(16.32±4.03 vs 3.11±0.87)pg/ml,with difference in statistics(t=19.75,P<0.000 1).The expression lev-els of IL-1β in serum sample from experimental and control groups were(57.12 ± 12.98 vs 13.45 ± 4.78)pg/ml,with difference in statistics(t=19.46,P<0.000 1).The percentage of CD93+exosomes was positively correlative with IFN-γ, IL-17,IL-1β(r=0.488,0.456,0.532,P<0.01)in serum samples from the experimental group and there was statistical difference.Conclusion In the disease process of cryptococcal meningitis,the expression of CD93 on exosomes might involve in the diseases'processes by affecting the CD4+T cells.%目的 检测隐球菌脑膜炎患者血清中外泌体表达 CD93的水平,进一步探究其临床意义.方法 实验组为2012年1
1月~2016年12月在上海长海医院和长征医院确诊的38例隐球菌脑膜炎患者的血清,诊断标准为脑脊液染新生隐球菌阳性或培养阳性;对照组为同期收集的38例健康人血清.血清外泌体的分离采用超高速离心法;外泌体表面抗原的鉴定采用磁珠捕获结合流式细胞仪检测法;血清中细胞因子用 ELISA法进行蛋白定量.实验组与对照组检测值的比较采用两独立样本的t检验,两变量之间的相关性以 Pearson系数表示.结果 流式结果表明,实验组血清外泌体中 CD93的表达水平高于对照组为(79.11±19.31 vs 23.98±6.56)%,差异具有统计学意义(t=16.66,P<0.0001).IFN-γ在实验组与对照组血清中的表达水平为(39.78±10.77 vs 58.98±16.99)pg/ml,差异具有统计学意义(t=5.884,P<0.0001);IL-17在实验组与对照组血清中的表达水平为(16.32±4.03 vs 3.11±0.87)pg/ml,差异具有统计学意义(t=19.75,P<0.0001);IL-1β在实验组与对照组血清中的表达水平为(57.12±12.98 vs 13.45±4.78)pg/ml,差异具有统计学意义(t=19.46,P<0.0001).实验组血清中CD93+exosomes所占的百分比与 IFN-γ,IL-17,IL-1β的蛋白表达量呈正相关(r=0.488,0.456,0.532,均P<0.01).结论 隐球菌脑膜炎疾病过程中,CD93在外泌体的表达可能通过影响 CD4+T细胞参与了该病病程. 【期刊名称】《现代检验医学杂志》
【年(卷),期】2017(032)006
【总页数】3页(P23-25)
【关键词】手指假肢隐球菌脑膜炎;外泌体;CD93;白介素-1β;白介素-17
【作 者】李腾达;刘鹏;龙曙萍;刘云;黄元兰;张薇薇;郭杰;谷明莉;邓安梅阀门防火罩
【作者单位】第二军医大学长海医院,上海 200433;第二军医大学长海医院,上海 200433;第二军医大学长海医院,上海 200433;第二军医大学长海医院,上海 200433;解放军455医院,上海 200052;第二军医大学长海医院,上海 200433;第二军医大学长海医院,上海 200433;第二军医大学长海医院,上海 200433;第二军医大学长海医院,上海 200433
【正文语种】中 文
【中图分类】R519.4;R392.11
新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)广泛存在于土壤和鸽粪中，是一种哺乳动物机会性致病真菌[1]。近年，肿瘤化疗药物及免疫抑制药物的使用、艾滋病的流行等原因使得隐球
菌脑膜炎的发病率呈逐年上升的趋势[1，2]。研究表明在机体抵抗隐球菌感染的免疫过程中，CD4+T细胞起到了重要作用，其包含有Th1，Th2，Th17等亚，可募集巨噬细胞和粒细胞等到隐球菌肺部感染病灶杀伤病菌，同时存在于肺部的巨噬细胞也可通过分泌细胞因子激活机体适应性免疫活性[2，3]。
老化仪外泌体(exosomes)是一种纳米级胞外囊泡，其表面有丰富的CD63，CD9等抗原，研究表明癌细胞分泌的外泌体可作用于临近细胞影响其功能的表达，亦可经循环系统作用于远端脏器形成肿瘤转移前龛盒，有利于肿瘤转移[4]。在动物感染模型-老鼠病模型中，被感染细胞分泌的外泌体能诱导脾脏CD4+和CD8+T细胞，激活记忆性CD4+和CD8+T细胞增殖以及IFN-γ的生产[5]，证明外泌体可能参与了机体抵抗病原体的免疫炎症过程。CD93是一种跨膜糖蛋白，在调节固有免疫反应及炎症反应，维持机体稳态方面具有重要作用[6]，是参与自身免疫疾病如类风湿性关节炎病理进程的因子之一[7]，但其在隐球菌脑膜炎中的研究尚未进行。基于此，本实验对隐球菌脑膜炎患者血清外泌体中的CD93表达水平进行检测，初步探究其临床价值，为疾病监测和提供潜在靶位点。
1.1 研究对象 以38例2012年11月～2016年12月在上海长海医院和长征医院确诊的隐球菌
脑膜炎患者血清作为实验组，诊断标准为脑脊液染新生隐球菌阳性或培养阳性，患者男性13例，女性25例，平均年龄为38.7±5.2岁。健康对照组为同期体检的38例血清标本，男性14例，女性24例，平均年龄为39.1±5.7岁，实验组与对照组年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经第二军医大学长海医院医学科研伦理委员会批准，所有受试对象均签署知情同意书。
1.2 试剂与仪器 抗体(美国Abcam公司)，SM3-P100磁珠(Alrun Nano Science & Technology公司)，ELISA试剂盒(Thermo公司)，流式细胞仪(Beckman公司)，酶标仪(Thermo公司)，超速离心机(HITACHI公司)。
1.3 方法
1.3.1 受试对象血清收集：将研究对象非抗凝血于采集后1～2 h内进行2 500 g，10 min分离，亦可置于室温自然形成血清，将形成的血清于-80℃保存待用。
1.3.2 血清外泌体的分离：将患者血清经0.2 μm过滤器过滤，用PBS稀释到适合浓度后于2 000 g，离心20 min，收集上清，经0.2 μm过滤器过滤后于120 000 g，离心3 h，收集沉淀，用PBS重悬后重复离心再次收集沉淀，以PBS重悬待测。
光固化打印
1.3.3 磁珠-流式分析外泌体表面抗原：取适量SM3-P100磁珠溶液，用MEST洗涤后，以200 μl 5 mg/ml EDC及NHS进行活化，加入约10 μl 0.775 mg/ml抗体溶液与磁珠反应，37℃，3 h后除去上清，加1 ml PBST重悬温育30 min后，洗涤3次。加入100 μl外泌体，37℃摇1 h以使外泌体与抗体充分接触并连接，磁性分离连接的外泌体，并用PBS洗涤。最后加入1 ml 30 μmol/L Dio，对外泌体膜进行染，无水乙醇洗涤后待测。
1.3.4 ELISA试剂盒检测细胞因子：按照ELISA试剂盒操作说明检测血清中TNF-α，IFN-γ，IL-1β等因子的表达情况。
1.4 统计学分析 本研究中两连续计量资料的比较采用两独立样本t检验，两变量间的相关性用Pearson系数表示，检验水准α为0.05，分析软件为IBM SPSS Statistcs 21.0与Graph Prism 6.0。
2.1 实验组与对照组血清外泌体表面蛋白的表达水平 见表1。与CD9，CD63等外泌体表面固有蛋白相比，CD93在实验组血清外泌体中的表达明显增高，约是对照组的三倍，差异具有统计学意义(P<0.000 1)。
2.2 实验组与对照组血清中细胞因子的表达水平见表2。与对照组相比，实验组血清IFN-γ表达水平下降，IL-17与IL-1β表达水平上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；TNF-α与IL-4在实验组与对照组的表达不具有统计学差异(P>0.05)。
2.3 实验组血清CD93+外泌体与细胞因子的Pearson分析 实验组血清CD93+外泌体与IL-17，IL-1β，IFN-γ的蛋白表达量呈正比，差异具有统计学意义(r=0.456，0.532，0.488，均P<0.05)。与IL-4，TNF-α不具有相关性(r=0.311，0.276，均P>0.05)。寿盒
实时调试新生隐球菌是一种广泛存在于自然环境中的条件致病菌，主要侵犯免疫功能不全或低下的人如艾滋病患者[8]。在机体抵抗新生隐球菌的过程中，CD4+T细胞起到了重要作用，研究表明，在小鼠模型中Th1细胞分泌的IFN-γ，TNF-α等因子可激活体内的免疫活性，保护宿主抵抗隐球菌；对HIV相关的隐球菌脑膜炎分析显示，表达IFN-γ/TNF-α的CD4+T细胞与患者生存期限相关[2，3]。巨噬细胞及分泌的IL-1β等，在机体抵抗感染的免疫过程中也起到了重要作用，其与机体适应性T细胞之间的调节具有相互性，巨噬细胞分泌的细胞因子可诱导CD4+T细胞向Th1，Th2，Th17亚分化，诱导细胞产生IL-4，IL-17等因子，而适应性免疫细胞Th1型细胞因子IFN-γ，TNF-α等亦可通过经典途径激活巨噬细胞，上调对真菌有杀伤性的NO的产量，杀死胞内菌[2，3]。
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