苯并(a)芘
王瑞鑫1，冯亚净1，李秀缺2，李书国1
（1.河北科技大学生工学院，河北石家庄050018）（2.河北省食品检验研究院，河北石家庄
050031）
摘要：采用 2.0 G 聚酰胺-胺(PAMAM)、石墨烯(GS)和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐复合膜修饰玻碳电极(PAMAM /GS/IL/GCE)，包埋固定多环芳烃抗体，构建了一种纳米免疫传感器，用于快速测定粮油食品中的苯并(a)芘(BaP)。在pH 为7.0含1 mmol/L K 3[Fe(CN)6]和0.1 mmol/L KCl 的磷酸盐缓冲溶液中，基于多环芳烃抗体与抗原之间的特异性免疫反应，以K 3[Fe(CN)6]为探针，利用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究其免疫反应对传感器响应电流的影响。在优化实验条件下，免疫传感器的峰电流随溶液中BaP 浓度的增大而减小，且峰电流与BaP 浓度在0.1~100 ng/mL 范围内呈线性关系，其检测限为0.03 ng/mL （S/N=3）。该免疫传感器的稳定性和重现性较好，利用该法对玉米油和菜籽油等样品中的苯并(a)芘进行检测，回收率在94.46%~103.36%，检测结果与HPLC 法基本一致，用于粮油食品中苯并(a)芘的快速检测是可行的。
关键词：苯并(a)芘；2.0 G 聚酰胺-胺；石墨烯；离子液体；食品安全
文章篇号：1673-9078(2016)9-295-301 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.9.042
An Electrochemical Immunosensor for Rapid Quantification of
Benzo(a)pyrene in Grain- and Oil-related Foods
WANG Rui-xin 1, FENG Ya-jing 1, LI Xiu-que 2, LI Shu-guo 1
(1.Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China) (2.Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050031, China)
Abstract: A nanoimmunosensor for rapid quantification of benzo(a)pyrene (BaP) in food was constructed by modifying the glassy carbon electrode (GCE) with 2.0 G polyamidoamine (PAMAM), graphene (GS), and a 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate composite film and by immobilizing the antibody against polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on the surface of the GC
E. On the basis of the specific immune reaction between the anti-PAH antibody and antigen, the effects of the immune response on the immunosensor response current were studied by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry using K 3[Fe(CN)6] as the probe in phosphate buffer (pH=7.0) containing 1 mmol/L K 3[Fe(CN)6] and 0.1 mmol/L KCl. At optimized experimental parameters, the peak response current of the immunosensor decreased with the increasing BaP concentration, and the response current showed a linear relation with the concentration of BaP in the range 0.1–100 ng/mL, with a detection limit of 0.03 ng/mL (S/N=3). The prepared anti-PAH/PAMAM/GS/IL/GCE immunosensor showed excellent stability and reproducibility. The newly developed method was applied to analysis of BaP content in peanut and rapeseed oil samples, and the recovery rate was in the range of 94.46~103.36%. The results were generally consistent with those obtained by high-performance liquid chromatography (HPLC) method; therefore, the proposed method is feasible for rapid quantification of BaP in grain- and oil-related foods.
Key words : benzo(a)pyrene; 2.0 G polyamidoamine; graphene; ionic liquid; food safety
苯并(a)芘(BaP)是一种常见的具有致癌性、致畸性和致基因突变性的剧毒物质[1]。BaP 是由一个苯环和
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收稿日期：2015-10-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目（20876165）；河北省食品药品安全科技项目计划项目（ZD2014011）
作者简介：王瑞鑫（1992-），男，硕士研究生，研究方向：食品科学与安全 通讯作者：李书国(1969-)，男，工学博士，教授，研究方向：粮油食品安全技术
一个芘分子稠合而成的多环芳烃类化合物，不溶于水，
能溶于正己烷等有机溶剂，碱性环境下稳定，而遇酸则不稳定[2]。世界各国对粮油食品中BaP 的含量进行严格的控制。欧盟国家出台了最为严格的限量标准为2.0 μg/kg （油脂中）。我国根据GB 2762-2012规定油脂及其制品中BaP 含量的限量标准为10 μg/kg [3]。因此建立检测速度快、灵敏度好和准确性高的BaP 分析方法意义重大。
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目前，检测BaP 的方法主要有荧光法[4~5]、高效液相谱法[6~8]、气相谱-质谱法[9~10]及酶联免
疫吸附法[11~12]等。上述方法各有优缺点，荧光法检测限低和灵敏度高，但存在背景干扰和光谱重叠等问题；高效液相谱法和气相谱-质谱法灵敏度高、精确度好，但存在操作繁琐和仪器昂贵等缺点；酶联免疫吸附法检测速度快，但检测精度不足。免疫传感器法通过将抗原/抗体间免疫反应信号转换为电化学信号，依据目标物不同浓度下信号的规律性变化完成检测，随着特异性抗体不断地被研发出来，凭借其检测灵敏度高和特异性好的优势，也成为BaP 检测的一种方法，得到迅速发展。
本文以BaP 为研究对象，采用2.0 G 聚酰胺-胺、石墨烯和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐（一种离子液体）复合膜(PAMAM/GS/IL)修饰玻碳电极，将多环芳烃抗体经整代聚酰胺-胺分子表面的大量氨基固定在电极表面，制备了一种无标记的电流型免疫传感器。该免疫传感器利用具有大氨基的树枝状PAMAM 大分子分散具有高比表面积的石墨烯和良好生物兼容性的离子液体来固定抗体，小尺寸的石墨烯粒子能给抗体提供更自由的取向，同时通过PAMAM 分子中大量氨基增加了抗体在传感器表面的固定量，依据不同浓度的BaP 与抗体结合后，免疫传感器峰电流与溶液中BaP 的浓度呈线性关系来测定BaP 的含量。本方法具有灵敏度高、检出限低、稳定性好和快速简便等优点，可用于食品中BaP 的检测。
1 实验部分 1.1 仪器与设备
LK98B Ⅱ型微机电化学分析系统：天津兰力科化学电子高技术有限公司；三电极系统（3 mm 玻碳圆
盘电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl 电极为参比电极）、电解杯：上海CHI 仪器公司；LC-10A 型高效液相谱仪：日本岛津公司；FA 2204型电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；KQ 2200型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；TGL-10B 型高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；场发射扫描电镜（HITACHI S-4800-Ι型）：日本Hitachi 公司；RE52CS-1型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；GZX-9070 MBE 型电热鼓风干燥箱：上海实业有限公司医疗设备厂；HH-S6型恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司。
1.2 材料与试剂
聚酰胺-胺（2.0 G ，末端官能团为氨基），威海晨源分子新材料有限公司；石墨烯（99%），北京德科岛金科技有限公司；对氨基苯甲酸（分析纯）、N-羟基琥珀酰亚胺（98%）、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（98%）、3,4-苯并芘（96%）和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐（97%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；多环芳烃抗体，Santa Cruz 公司；牛血清白蛋白（96%），上海翊圣生物科技有限公司；N,N 二甲基甲酰胺（分析纯），天津市达森化工产品销售有限公司；正己烷（分析纯），天津市津东天正精细化学试剂厂；花生油、菜籽油购自石家庄市某农贸市场。
1.3 方法
1.3.1 PAMAM/GS/IL 修饰物的制备
将0.01 g 聚酰胺-胺（PAMAM ）溶解在10 mL 甲醇中，制得聚酰胺-胺溶液，于4 ℃储存。在10 mL N,N 二甲基甲酰胺（DMF ）中加入0.01 g 石墨烯，超声处理15 min ，制得均匀分散的石墨烯悬浮液。取5 mL 石墨烯悬浮液加入5 mL 聚酰胺-胺溶液中，超声处理30 min ，使石墨烯均匀地分散在聚酰胺-胺溶液中，得到聚酰胺-胺-石墨烯悬浮液（PAMAM/GS ）。取200 μL 1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐（IL ）加入上述聚酰胺-胺-石墨烯悬浮液，超声处理1 h ，使离子液体均匀地分散在聚酰胺-胺-石墨烯中，得到聚酰胺-胺-石墨烯-离子液体修饰液（PAMAM/GS/IL ），于4 ℃储存，备用。
1.3.2 电化学免疫传感器的制备
将玻碳电极（GCE ）用Al 2O 3粉末（粒径0.05 μm ）打磨抛光，至电极表面成镜面，再依次于硝酸溶液（体积分数为50%），无水乙醇和去离子水中各超声处理3 min ，N 2吹干，备用。
免疫传感器的制备过程见图1。利用三电极系统，即经预处理的玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 为参比电极、铂丝电极为辅助电极，在-1.5~1.0电位区间内，以50 mV/s 的扫速在新配制的1 mmol/L 对氨基苯甲酸溶液中进行循环伏安（CV ）扫描15圈。冲洗玻碳电极，在电极表面滴加5 μL 新配制的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS ）和1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC ）混合溶液（其中NHS 为100 mmol/L ，EDC 为400 mmol/L ），活化处理2 h 。在电极表面滴加5 μL PAMAM/GS/IL ，通过PAMAM 中氨基与电极表面经EDC/NHS 活化后的羧基发生酸胺缩合反应的方式固定于电极表面。室温晾干，在电极表面滴加5 μL 多环芳烃抗体（anti-PAHs ），37 ℃下孵育 2 h ，
anti-PAHs经PAMAM中氨基固定在修饰电极表面。最后在电极表面滴加5 μL 1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4），4 ℃下封闭30 min，以消除非特异性吸附，得到PAMAM/GS/IL/anti-PAHs修饰的电化学免疫传感器，于4 ℃保存待用。
图1 免疫传感器的制备及免疫过程
Fig.1 Construction of the immunosensor and the corresponding
环保材料服装immune reaction
1.4 免疫传感器法测定BaP的标准曲线
在PAMAM/GS/IL/anti-PAHs修饰的玻碳电极表面分别滴涂不同浓度梯度（0.1~100 ng/mL）的BaP标准溶液，在37 ℃条件下孵育30 min。采用三电极系统（PAMAM/GS/IL/anti-PAH/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极），于1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）进行电化学表征和检测分析。运用循环伏安法（电压：-0.2~0.6 V，扫描速度：50 mV/s）对于免疫传感器的制备步骤进行电化学表征，运用差分脉冲伏安法（电位：-0.2~0.6 V）测定并记录不同浓度BaP的峰电流值I p，分析I p与相对应的BaP浓度间的关系，并依据其线性关系对BaP浓度做标准曲线。
1.5 植物油样品中苯并(a)芘的测定
eoo1.5.1 样品前处理
分别取1 g花生油、菜籽油样品，置于25 mL 烧杯中，加入10 mL乙腈饱和正己烷，超声处理20 min，充分溶解以后，移至分液漏斗中，用25 mL正己烷饱和乙腈萃取三次，合并下层乙腈层在45 ℃水浴中
旋转蒸发至干，用乙腈：四氢呋喃（90:10）溶剂分三次淋洗旋蒸瓶，并定容至1 mL，接着移入50 mL离心管中，样品提取液以5000 r/min离心10 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后进行检测。高压mos管
1.5.2 免疫传感器法测定
在制备好的纳米免疫传感器上滴加2 μL处理好的样品提取液，在37 ℃条件下孵育30 min，然后利用差分脉冲伏安法测定免疫反应响应电流。每个样品测定三次，取三次测定的电流值平均值作为该样品的免疫响应电流值，将该免疫响应电流值代入1.4中得出的免疫响应电流与苯并(a)芘浓度的线性回归方程，计算植物油样品中BaP的含量。
1.5.3 高效液相谱法测定
谱条件：C18柱(4.6 mm×250 mm)，粒径5 μm；流动相为乙腈：水（90:10，V/V）；流速为1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；激发波长为384 nm，发射波长为406 nm[13]。
准确称取25 mg苯并(a)芘标准品，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，作为储备液保存于4 ℃条件下。使用前依据需求配成相应浓度梯度的标准溶液，取20 μL标准溶液进样，记录其HPLC图谱，根据所得峰面积与对应的BaP浓度绘制标准曲线。分别取上述处理好的花生油、菜籽油样品提取液20 μL，进行HPLC检测，每个样品测定三次，取三次测定平均值作为该样品的图谱峰面积，依据上述标准曲线计算样品中BaP浓度，并与电化学检测方法的结果进行对比。
1.5.4 数据统计分析方法
以上测定均为三组平行实验，结果取三组实验数据的平均值。运用SPASS 18.0软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析（ANOV A）进行显著性差异分析（p<0.05），论文中的数据图利用Origin Lab Origin Pro V9.0软件绘制。
2 结果与分析
2.1 PAMAM/GS/IL修饰电极的电化学表征
图2 不同修饰电极的循环伏安图
Fig.2 Cyclic voltammograms of various modified electrodes 注：a. bare GCE；b. PAMAM/GCE；c. PAMAM/GS/GCE；
d. PAMAM/GS/IL/GCE。
在 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS（pH=7.0）的测试底液中，采用循环伏安法
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对裸玻碳（a ）、PAMAM/GCE （b ）、PAMAM/GS/GCE （c ）和PAMAM/GS/IL/GCE （d ）进行表征（见图2）。Fe(CN)63-/4-在裸玻碳电极上出现一对较好的氧化还原峰。当修饰PAMAM 后，氧化还原峰电流略微增加。当修饰PAMAM/GS 后，氧化还原峰电流明显增大，GS 的引入明显提高了电极的电化学响应，这是由于GS 粒子通过PAMAM 固定在电极的表面，具有突出电学性能的GS 粒子相当于纳米尺寸的微电极，可作为电子与电极之间电子传递的微通道。当电极的表面修饰了PAMAM/GS/IL 后，其氧化还原峰的电流进一步增大，可根据Randles-Sevcik 方程求出不同修饰过程中电极的电活性面积：
I p =2.69×105A D 1/2n 3/2γ1/2C
其中A 为有效电极面积（cm 2）；I p 阳极峰电流（μA ）；D 为扩散系数（7.6×10-6 cm 2/s ）；n 为参与氧化还原反应的电子数（n =1）；γ为电位变化速率（0.05 V/s ）；C 为K 3[Fe(CN)6]的浓度（1 mmol/L ）。
计算得，裸玻碳电极和PAMAM/GS/IL/GCE 的
感应式冲洗阀电活性面积分别为0.075 cm 2和0.17 cm 2。
由二者的电活性面积可知，加入具有优良电化学性能的GS 和IL ，提高了修饰电极的电化学性能和稳定性，从而提升了免疫传感器的灵敏度。
2.2 免疫反应的电化学表征
轮椅电机
图3 修饰电极免疫前后的循环伏安图
Fig.3 Cyclic voltammograms of the modified electrode before
and after the immune reaction
注：a. bare GCE ；d. PAMAM/GS/IL/GCE ；e. anti-PAHs/ PAMAM/GS/IL/GCE ；f. BaP/ anti-PAHs/PAMAM/GS/IL/GCE 。
当在PAMAM/GS/IL/GCE 表面滴加anti-PAHs 以后，氧化还原峰的电流下降（见图3），这是由于抗体作为蛋白质的绝缘性阻碍电子的传递，这就说明anti-PAHs 已经成功固定在电极表面上。在经BSA 封闭后的PAMAM/GS/IL/anti-PAHs/GCE 表面滴加BaP 标准溶液后，anti-PAHs 和BaP 发生特异性结合生成免疫复合物，增加了电极表面的空间位阻，从而使得
探针Fe(CN)63-/4-的氧化还原峰电流进一步降低（如图
3中的e 与f 线），这表明anti-PAHs 和BaP 的特异性免疫结合成功。
图4 电化学免疫传感器在不同扫描速率下的循环伏安图 Fig.4 Cyclic voltammograms of the immunosensor at different
scan rates
注：Scan rates ，a~g 为20、40、60、80、100、120和140 mV/s 。
在 1.0 mmol/L K 3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS （pH 7.0）测试底液中，-0.2~0.6 V 电位范围内，将PAMAM/GS/IL/anti-PAHs/GCE 在不同扫描速率下CV 扫描。如图4所示，随着扫描速率的增加，氧化还原峰的电流均增加，扫描得到的氧化峰和还原峰的电流值都分别与扫描速率的平方根成线性关系：氧化峰y=2.8201x-1.8419，线性相关系数R²=0.9984；还原峰y=-2.5485x-0.3695，线性相关系数R²=0.9973。说明该电极反应受扩散过程控制。
2.3 实验条件的优化 2.
3.1 修饰液的配比和用量
修饰液的配比会对免疫传感器的性能造成影响，按照PAMAM 和GS 的体积比为0.5、1和2配制PAMAM/GS 的混合液2 mL ，并添加40 μL 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，分别取5 μL 进行电极的修饰，运用循环伏安法测定其电流大小，经实验发现，PAMAM 和GS 的体积比1时，电流是最大的，因此，选择二者体积比为1，并添加40 μL 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为修饰液的配比。PAMAM/GS/IL 修饰液的用量会影响电子的传递，分别将1、2、3、4、5和6 μL 的PAMAM/GS/IL 复合物滴涂在经电聚合处理玻碳电极上，采用CV 法测定电流的大小。如图5所示，氧化峰电流一开始逐渐增大，当用量为5 μL 时，电流最大。然后随PAMAM/ GS/IL 用量的增加，电流逐渐减小，综合考虑选择修饰液的用量为5 μL 。
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图5 修饰量对免疫传感器电流的影响
Fig.5 Effects of the volume of an added modifying solution on
the response current of the immunosensor
2.3.2 电解质溶液pH 对免疫传感器的影响
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图6 pH 对免疫传感器DPV 峰电流的影响 Fig.6 Effects of pH on the peak DPV current of the
immunosensor
测试底液的pH 对于抗体的活性和其在电极表面的固载量有重要影响。配制不同电解质溶液，采用DPV 法测定不同pH 的响应电流大小。如图6所示，在5.8~7.0范围内峰电流随pH 值的增加而增大，在pH 为7.0时达到最大，在7.0~7.8范围内峰电流随pH 值的增加而减小，表明免疫传感器在检测体系pH 为7.0左右时检测性能最好，这可能是因为在酸性或者碱性条件下，由于抗体中部分基团的质子化或解离导致抗体变性所致。因此，选择pH 为7.0的电解质溶液配制测试底液。
2.3.3 温育时间与温度对免疫传感器的影响防爆鼠标
多环芳烃抗体与抗原（BaP 标准溶液）的温育时间和温度对免疫传感器的性能有重要影响。在PAMAM/GS/IL/anti-PAHs/GCE 表面滴加2 μL 苯并(a)芘标准溶液，依次延长反应时间，采用DPV 法测定其响应电流的大小。如图7所示，在5~30 min 范围内峰电流随时间的增加而增大，说明抗原与抗体需要一定的时间，才能结合并形成稳定的免疫产物，当反应达到30 min 后，峰电流的变化较小，表明固定的多环芳烃抗体与的BaP 的结合达到相对饱和的状态。所以
选取30 min 为优化温育时间。在一定温度范围内，升温可以加速免疫复合物的形成，但升高温度增大了抗体失活的可能性。所以在优化温育时间的条件下，探究温育温度在15~40 ℃范围内对免疫反应的影响。如图8所示，在15~37 ℃温度范围内，响应电流随温度升高而增大，在37 ℃时达到最大值，当
温度高于37 ℃后，响应电流的值减少，这是由于高温破坏了免疫复合层，影响了免疫传感器的性能。所以选取37 ℃为优化温育温度。
图7 温育时间对免疫传感器DPV 峰电流的影响
Fig.7 Effects of incubation time on the peak DPV current of the
immunosensor
图8 温育温度对免疫传感器DPV 峰电流的影响 Fig.8 Effects of incubation temperature on the peak DPV
current of the immunosensor
图9 BaP 浓度对免疫传感器响应电流的影响
Fig.9 Effects of BaP concentration on the DPV current of the
immunosensor
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