罗小三，周东美，陈怀满
土壤与农业可持续发展国家重点实验室，中国科学院南京土壤研究所（210008）
E-mail:dmzhou@ & trhjhx@
摘要：本文简要介绍了元素形态分析的概念、方法及其应用，概括和评述了当前土壤重金属的形态分析方法，详细讨论了各种形态分离手段和痕量重金属的测定技术，提出了土壤重金属形态分析领域亟待解决的问题和发展方向。 关键词： 土壤 重金属 形态分析 环境
1. 引言
从上世纪70年代开始，环境科学家就认识到，重金属的生物毒性在很大程度上取决于其存在形态，元素总量已经不能很好地说明环境中痕量金属的化学活性、再迁移性、生物可给性以及最终对生态系统或生物有机体的影响［1,2］。事实上，重金属与环境中的各种液态、固态物质经物理化学作用后以各种不同形态存在于环境中，其赋存形态决定着重金属的环境行为和生物效应［3］。正因如此，通过元素形态分
析方法定量确认环境中重金属的各种形态已成为环境分析化学研究领域的新热点，其环境介质包括土壤、沉积物、水体、植物和食品等［4-6］。随着工作的不断深入，特别是分析测试技术的迅猛发展，元素的形态分析方法日趋完善，并且在化合物生物地球化学循环、元素毒性及生态毒性确定、食品质量控制、临床分析等领域显示出独特的作用[7]。
土壤环境处于大气圈、水圈、岩石圈及生物圈的交接地带，它是地表环境系统中各种物理、化学以及生物过程、界面反应、物质与能量交换、迁移转化过程最为复杂和最为频繁的地带。而重金属土壤污染对食品安全和人类健康存在严重威胁。因此，研究土壤中重金属的形态尤为重要。但土壤是一个多组分多相的复杂体系，类型多样，其组成、pH和Eh等差异明显，加上重金属来源不同、在土壤中的形态复杂，使得土壤中重金属形态分析更为困难[8]。
本文对元素形态分析的概念、方法、常用技术、应用进行了概括，对当前土壤中重金属的形态分析方法进行了详细介绍和评述，并提出了存在的问题和将来的预期发展方向。
2. 元素形态分析的概念
2.1 元素形态
元素形态的概念可追溯到1954年Goldberg为改善对海水中痕量元素的生物地球化学循环的理解而将其
引入[9]。其后，元素的形态得到广泛研究，但不同的学者对形态有不同的理解和认识。Stumm[10]认为形态是指某一元素在环境中的实际存在的离子或分子形式；
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Florence[11]认为形态分析即确定元素各单独的物理-化学形式，它们的总和构成样品的总浓度；也有学者认为重金属的形态包括价态、化合态、结合态和结构态等[12]。Ure[13]认为土壤中痕量元素的形态即其存在的定义的物类、形式或相的鉴定和量化（species、form or phase，可功能性地定义为如植物可给性物类，或依据用于分离它们的试剂／步骤操作性地定义，或定义为该元素特殊的化学化合物或氧化态）。
与元素形态(elemental speciation)有关术语的定义在多次痕量元素形态会议上被讨论，并在最近的一篇评论中给了出来，这些定义源于IUPAC接受的用语[14]。化学物种(chemical species)是指化学元素的某种特殊形式(specific form)，如分子态、络合结构或氧化态；元素形态(speciation of an element)指某元素具体的化学物种在某体系中的分布；形态分析(speciation analysis)即鉴别和测定元素各种形态，包括取样方法、测定及质量控制。
2.2 重金属形态分类
线圈骨架重金属在环境样品中的形态比较复杂，至今尚无分类的统一标准，而且形态的研究涉及不同的学科，各领域对重金属形态的划分和研究也有所侧重。如根据元素在样品中的稳定程度将其分为稳定态和不稳定态；根据元素在溶液中的电化学活性分为活性态和非活性态。目前水体中重金属的形态分析较为活跃，由溶解态和悬浮物吸附态的简单划分发展为：自由金属离子、不稳定无机络合物、不稳定有机络合物、不稳定有机物吸附态、不稳定无机物吸附态、稳定无机络合物、稳定有机络合物、稳定无机物吸附态、稳定有机物吸附态、颗粒态等物理和化学形式[15]。植物中重金属的形态常分作无机态和有机态。土壤重金属形态研究一般分溶解态(土壤溶液)和颗粒态(土壤固相)两方面，前者主要研究价态和化合态，后者研究其结合态。在土壤科学和环境化学研究中，往往用各种不同的浸提剂对土壤中的重金属进行连续抽提，并根据所使用的浸提剂对重金属的形态分组。由于浸提剂系列的组成和浸提方法不同，有水溶态、交换态、吸附态、有机结合态、松结有机态、紧结有机态、碳酸盐态、无定型氧化锰结合态、无定型氧化铁结合态、晶型氧化铁结合态、硫化物态和残渣态等多种形态说法[16]。以上皆为操作性定义分类，与重金属在环境中的真实形态还有一定距离，所以目前的重点是确定更深层次的元素形态，最科学地反映重金属的存在形态。
2.3 土壤重金属形态分析
玻璃钢酸洗槽
完整的形态分析方案应包括采样、样品预处理、物类分析和评价。最理想的方法是尽可能地进行原位分析，但多数情况下很难做到，样品的采集、保存和预处理就成了形态分析的重要一环[17]。样品预
处理的关键在于防止处理过程中形态(如氧化态、络合程度、有机金属状态)的转变。近似原位分析的直接形态分析主要针对固相表面和土壤液相重金属的形态，通常的土壤重金属形态分析还得经过形态分离、测定等程序。由于土壤中重金属的含量很低，所以形态分析要求分离方法必须选择性好、回收率高，测试方法要求灵敏度高、准确度高、重现性好的痕量或超痕量分析方法。
3. 重金属化学形态的分析
3.1 电化学方法
电化学分析方法可有效地用来分析溶液中痕量重金属形态，重金属的不同化学形态可以在电极上逐级进行反应 [18,19]。近年来由于脉冲极谱法、单扫描极谱法以及新极谱法的兴起，
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阀门保温尤其是极谱催化波、络合物吸附波、溶出伏安法和电位溶出分析(PSA)等的成功应用，使得极谱分析具有灵敏度高（不少元素检出限可达10-8～10-11mol l-1，有的甚至可达10-10～10-12 mol l-1）、线形范围宽、分析速度快（利用导数单扫示波极谱，一般可不除氧，7～21s完成一次测定）等特点，在环境分析领域得到广泛应用[20]。
阳极溶出伏安法(ASV)：将重金属形态按其电极行为特征分为电极不稳态(ASV-labile)和惰性态(Inert)。
高压直流供电电极不稳态包括游离离子和一些简单无机络合物，被认为是可能的毒性态；惰性态一般是一些结合紧密的有机络合物，较少具有毒性特征。电极动力学过程与重金属穿过细胞膜进入细胞的过程类似（如图1所示），所以ASV能较好地反映出重金属的毒性[21]。缺点是溶液中存在的腐殖酸（HA、FA）和其它有机物影响电极富集和溶出过程，给定量带来误差。采用ASV 法可以同时分析As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，检出限为0.2 ppb[22,23]。微分脉冲阳极溶出伏安法(DPASV)因其高灵敏度已得到广泛应用[24,25]：Santos 等[26]对不同形态的Zn、Cd、Pb、Cu进行了同时测定，Sébastien [27]分析了土壤溶液中Pb的形态。
图1 金属络合物透过细胞膜示意图
ML—非脂溶性金属络合物 ML’— 脂溶性金属络合物 P—运载蛋白 M2+—金属离子 阴极溶出伏安法(CSV)：比ASV具有更高的灵敏度，并且较少污染样品。Barra[28]通过SWCSV，在Cu(Ⅱ)及溶解氧存在时测定了自然水体中的无机As形态(Ⅲ、Ⅴ)，方法灵敏，检出限为ppb级。Li 等[29]采用[Cr(Ⅲ)-DTPA络合物吸附]-催化阴极溶出伏安法(CCSV)，通过区分Cr(VI)、活性无机Cr(Ⅲ)及非活性有机Cr(Ⅲ)
络合物，确定自然水体(包括土壤排水)中Cr形态。Ferri [30]用DPCSV分析ng/l水平的Se(IV)。Xue [31]通过配体交换(LE)和DPCSV研究了淡水(包括地下水)中Ni形态及络合动力学。Sedlak [32]用竞争配体平衡(CLE)-CSV及螯合树脂柱分配(CRCP)-GFAAS通过区分不稳定态(即金属阳离子、无机络合态和弱有机络合态)、中强有机络合态(如腐殖物质络合物)和强有机络合态(如多齿配体络合物)，确定污染水体中Cu、Ni形态。
Korolczuk [33]通过灵敏的高选择性步骤，用伏安法测定了在Cr(Ⅲ)及HA存在时的痕量Cr(VI)浓度，检出限pM，并应用于土壤样品。根据PbTTMAPP在-0.74v(vs.SCE)的络合吸附波，利用导数示波极谱研究水体中痕量Pb的形态，对溶解态自由铅离子、络合铅离子、总铅以及悬浮态铅进行测定，检出限为0.002ppm [34]。Adeloju[35]在Cu(Ⅱ)存在时，用玻碳汞膜电极通过恒电流阴极溶出电位法(CSP)测定As(Ⅲ、Ⅴ)。计时电位溶出分析(CPSA)对研究宽范围配体/金属比时的金属离子络合状况有很大潜力[36]。离子选择性电极(ISE)可以直接测定金属阳离子和小分子无机阴离子的行为，常用于分析不同氧化态的元素，缺点是线形响应范围都在高浓度区（一般在10-6 mol l-1以上）。化学修饰电极、微电极也是具有潜力的电化学分析技术[37]。
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3.2 同位素方法
树脂吸附
灵敏度高，可测出10-14-10-13mol l-1，测量简便，不受其它非放射性杂质的干扰，省略了许多复杂的样品处理和分离手段，能进行原位测定。同位素示踪技术可以考察金属元素形态的来源、路径、生物有效性及转变情况[38]。同位素稀释技术起初用来评价土壤中重金属的植物有效性，Scheifler[39]则用该法评价了土壤中不同形态Cd的动物有效性。
3.3 表面分析技术
许多X射线吸收或衍射技术可用来对固体样品中的金属化学形态进行分析，如EXAFS、XANES、XRD及微探针分析[40-42]。EXAFS与PCA和LSF联用对土壤或沉积物中痕量元素形态的定量测定被认为是个有意义的途径[43]。X射线荧光（XRF）、TXRF、激光微探针质谱（LMMS）、扫描电镜(SEM)、紫外光电子能谱等也是表征表面元素形态和分布的有用工具[41,44]。
NMR、UV-Vis、IR、Mossbauer、ESR等技术也可用于形态分析，但由于敏感性和特异性问题常需将化合物分离。NMR对阐释金属配体络合物的K d尤其有效。
4.重金属的形态分离
环境样品中重金属的含量一般很低，各形态分量则更低，因此有必要在测定各形态之前进行分离富集，同时减少基体干扰，最终降低分析方法的检出限。
4.1 固相(土壤／沉积物)重金属的形态分离
土壤中痕量元素形态的确定通常由连续提取(sequential extraction)来实行，即用一系列化学活性(酸性、氧化还原能力和络合性质)不断增强的试剂逐级提取与土壤固相特定化学基团结合的重金属元素。其最大特点是用几种典型的提取剂取代自然环境中数目繁多的化合物，模拟自然条件下重金属与周围环境发生的各种反应，使复杂问题得以简化。提取剂可以为盐电解液(如CaCl2、MgCl2)、弱酸缓冲液(如HAc、(COOH)2)、螯合剂(如EDTA、DTPA)、强酸(如HCl、HNO3、HClO4)或碱(如NaOH、Na2CO3)等。
Tessier法：1979年由Tessier建立[45]，它将样品中的重金属元素通过五步分级提取，分别为：①可交换态(1.0 mol l-1 MgCl2, pH 7.0或1.0 mol l-1 NaOAc, pH 8.2)；②碳酸盐结合态(1.0 mol l-1 NaAc, pH 5.0)；③Fe-Mn氧化物结合态(25% HAc + 0.04 mol l-1 NH2OH-HCl)；④有机结合态(0.02 mol l-1 HNO3 + 30% H2O2 pH 2.0, 20% HNO3中3.2 mol l-1 NH4OAc)；⑤残留态(HF-HClO4)。在此基础上，其后的十几年里不同的研究人员根据各自的研究目的和对象出发，采用的连续提取法各有所异[46,47]，主要包括各个形态的分级和提取剂的选择两个方面，文献[16]对此作了概括。Tessier法是近20年来土壤科学、环境科学和地球化学等领域广泛采用的固相重金属形态分级体系[48-50]。连续提取法最大的缺陷是试剂的选择性差和释出金属在各形态间的再分配，而且由于这些方案的操作性定义特征，数据可比性和使用的提取程序紧密相关，只有用类似方法及性质相似的样品进行的分析结果才具
有可比性，这就要求程序的标准化[51]。
BCR法：1987年开始的BCR项目(即后来的SM&T项目)致力于连续提取的方法标准化和被鉴定的参考物质(certified reference materials，CRMs)的制造，1992年专题讨论会后方法逐渐形成[52]，系列成果在International Journal of Environmental Analytical Chemistry（1994,51,1/4）以专集刊出。它对样品进行三步分级提取：①水溶态、可交换态
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和碳酸盐结合态(0.11 mol l-1 HOAc)；②铁／锰氢氧化物结合态(pH 2时0.1 mol l-1 NH2OH-HCl)；③有机物及硫化物结合态(pH 2.0时先8.8 mol l-1 H2O2后1.0 mol l-1 NH4OAc)。近来也有学者对其进行优化，第四步残渣态用王水消化[53]。CRMs的使用是被广泛认可的用来确证形态分析中所用分析技术精确性的工具。标准参考物质(standard reference materials，SRM)在BCR法中已有应用[54]。
应用BCR法，Davidson [55]分析了沉积物中重金属的形态，发现BCR法的重现性很好；Tokaliolu[56]用BCR四级提取和FAAS检测，对沉积物中Cr、Co、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb和Mn 形态进行了分析，回收率≥95%，检出限0.04 - 0.69 g ml-1。此法在国内还未被广泛应用，但也有学者采用BCR法提取、ICP-AES测定研究了水体沉积物中重金属的形态并评估了重金属的生物有效性[57]。
其它提取法：超临界流体提取(SFE)、微波辅助提取(MAE)、加速溶剂提取(ASE)、超声提取(USE)最近都有报导[58-60]。Heltai等[61]结合CO2和H2O作提取剂的SFE技术分析了废水沉积物中重金属的形态，将其分为水溶态、碳酸盐结合态和可移动有机结合态，该法的化学解释可与BCR法相比。SFE被认为是有希望能限制形态转化的提取技术[62]。MAE因为能在大气或更高压力及可变的温度、溶剂和时间下进行而达到最温和的提取条件，使得它成为最吸引人的通用样品制备技术。
4.2 液相重金属的形态分离
样品预处理后，形态分析要求各不同元素物类在导入检测器前尽可能地分离干净。随着新仪器的开发、研制及前处理技术的发展，用现代化的分离和检测手段相结合已成为重金属形态分析的主流。谱在形态分析的发展中处于重要地位。
高效液相谱(HPLC)：LC是应用最广泛的元素形态分离方法。通常根据所分析物类的相对极性、溶解性、分子量对所用的LC分类，有反相谱(RPC)、反相离子对谱(RPIPC)、胶束、离子交换谱(IEC)、空间排斥谱(SEC，也称凝胶渗透谱)、手性液相谱(CLC)等模式。最流行的UV-Vis检测器因其低灵敏度而很少用，荧光或电热检测器更常用，通用型检测器有FID、ECD、TID、NPD、FPD等。HPLC的柱后反应检测灵敏度可达pg级。Kota [62]介绍了各种LC在Cr形态分析中的应用。
Petropoulou 等[63] 对土壤提取液中Se形态进行分析，用强阴离子交换谱-ICP-MS分离测定了SeU
动态沙盘、SeE、SeM、Se(VI)和Se(IV)，用RPC-ICP-MS分离测定了dMeSe和dMedSe。反相LC是现在最流行的与ICP-MS联用的分配谱模式。Guerin [64]将反相及离子交换HPLC 用于As、Se形态分离。Gallardo 等[65]对环境固体样品磷酸提取液进行分析，通过离子交换HPLC-HG-AFS获得As各形态较低的检出限(0.02 - 0.04 mg kg-1)，是有潜力的常规形态分析方法。Vassileva 等[66]用IEC-ICP-MS分析了地下水和土壤提取液中Se及五种As形态[As(Ⅲ)、As(V)、甲基砷酸、二甲基砷酸和砷甜菜碱]。SEC基于试样分子的尺寸和形状来实现分离，可用来研究重金属离子与有机物不同组分的配位能力[67]。金属螯合物液相谱法是目前HPLC测定金属离子最常用的方法。
气相谱(GC)：用于分析挥发性的热稳定的元素物类，对非挥发性化合物可使其衍生化。应用各种不同检测器，检出限可低至ppt以下，GC-TID(离子阱检测器)在提高灵敏度方面有
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