(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810811003.1
(22)申请日 2018.07.23
(71)申请人 广东唯泰生物科技有限公司
地址 528200 广东省佛山市南海区桂城夏
南路61号创越时代文化创意园一座8
层
(72)发明人 朱建斌 江嘉豪 何美第 陈炽峰
康斯敏 陈碧莹 蔡祥胜 王明珠
王进辉
(74)专利代理机构 广州新诺专利商标事务所有
限公司 44100
代理人 许英伟
(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)
(54)发明名称一种人羊膜间充质干细胞分离、培养及纯化方法(57)摘要本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤：(1)采集人胎盘组织并分离羊膜组织，清洗血迹；(2)将羊膜组织剪碎，加入第一组织消化液进行消化；(3)消化结束后去除第一组织消化液，清洗所述羊膜组织，加入第二组织消化液进行消化；(4)消化结束后加入胰蛋白酶液进行消化；(5)加入终止液终止消化，过滤去除未消化完全的组织块，收集细胞悬液离心；(6)去除上清液，加入DMEM清洗沉淀，再次离心，得到分离后的人羊膜组织间充质干细胞。本发明的方法简单有效，能够得到高纯度的羊膜间充质干细胞，而且对细胞活性无任何影 响。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 108865988 A 2018.11.23
C N 108865988
A
1.一种人羊膜间充质干细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：
医用护理床(1)采集人胎盘组织并分离羊膜组织，清洗血迹；
(2)将所述羊膜组织剪碎，加入第一组织消化液进行消化；
(3)消化结束后去除所述第一组织消化液，清洗所述羊膜组织再剪碎，加入第二组织消化液进行消化；
(4)消化结束后加入胰蛋白酶液进行消化；
(5)加入终止液终止消化，过滤去除未消化完全的组织块，收集细胞悬液离心；
(6)去除上清液，加入DMEM清洗沉淀，再次离心，得到分离后的人羊膜组织间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一组织消化液包括DMEM、以及基于所述DMEM体积10mg/ml的中性蛋白酶和1mg/ml的DNA酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组织消化液包括DMEM、基于所述DMEM体积3mg/ml的I型胶原酶和0.3mg/ml的DNA酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述羊膜组织与所述第一组织消化液的体积比为1:1。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述第二组织消化液的体积与所述羊膜组织的体积相同。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述胰蛋白酶液的体积与所述第二组织消化液的体积相同。
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7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶液的浓度为0.05％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述终止液的体积与所述胰蛋白酶液的体积相同。
9.一种人羊膜间充质干细胞培养及纯化方法，其特征在于，按权利要求1至8任一项所述的方法得到所述人羊膜组织间充质干细胞后，使用选择性培养基进行细胞培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述选择性培养基包括无血清培养基、以及基于所述无血清培养基体积15ng/ml的bFGF和10ng/ml的HGF。
权 利 要 求 书1/1页CN 108865988 A
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一种人羊膜间充质干细胞分离、培养及纯化方法
加热搅拌反应釜技术领域
[0001]本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞分离、培养及纯化方法。
背景技术
[0002]间充质干细胞(MSC)是一类来源于中胚层的具有高度自我更新和多向分化能力的多能干细胞，可以在体外培养扩增并在特定条件下具有多向分化能力，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肝脏细胞，甚至还可以横向分化为神经细胞、表皮细胞等，MSC具有广阔的临床应用前景，是再生医学和组织工程领域中最重要的种子细胞。
[0003]间充质干细胞最早被发现于骨髓组织中，随着研究的深入，在人体多种组织中也相继被发现，
如骨髓、脂肪、脐带、胎盘等。羊膜组织属于胎盘组织，是包裹胎儿和羊水的一层半透明膜，胎儿出生后随胎盘一起排出母体，属于孕妇产后的废弃物。羊膜组织中无血管、神经和淋巴管分布，具有一定的弹性，厚度在0.02-0.5mm之间，在电子显微镜下，羊膜组织横截面由外到内可以分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，其中上皮层主要由羊膜上皮细胞构成，羊膜间充质干细胞存在于致密层等皮下层中。
[0004]人羊膜间充质干细胞(hAMSC)和人骨髓间充质干细胞(hBMSC)具有相似表型，但是增殖能力比hBMSC更强，细胞状态更原始，同时hAMSC低表达HLA I类分子，不表达HLA II类分子，低免疫源性，异体使用不产生免疫排斥反应。羊膜组织数量多，来源充足，一个胎盘中的羊膜组织面积超过600cm2，而且羊膜组织容易从胎盘剥离，取材方便，羊膜间充质干细胞成为未来再生医学领域中重要的种子细胞。
[0005]羊膜组织消化后得到的细胞是异质性的，包含有羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞，两种细胞都为贴壁生长，在含血清培养基中生长迅速，通过常规方法很难彻底分离纯化，常用的方法是使用密度梯度离心法将其分离纯化，但是密度梯度离心操作复杂，不同浓度的Percoll配制及添加复杂。然而，采用密度梯度离心法只能分离传代培养后的细胞，此时细胞呈现不同形态，具有不同密度，无法纯化制备得到的原代细胞，而且上皮细胞很难和间充质干细胞分离，制备得到的间充质干细胞中常夹杂着上皮细胞，很难得到满意的细胞纯度。
方艺蒙[0006]除此之外，有研究使用胰酶两步法消化羊膜组织，去除羊膜上皮细胞，剩余的羊膜组织再次消化得到羊膜间充质干细胞。现有的羊膜上皮细胞分离大多采用胰蛋白酶消化的方法，该方法可以去除大部分羊膜上皮细胞，但是上皮细胞去除不完全，正常培养时候仍将相互影响，而且胰蛋白酶是一种广谱的蛋白质消化酶，消化过程对细胞损伤巨大，胰酶浓度和消化条件及消化时间很难准确把握，酶浓度过高或消化时间稍长即可能严重损伤组织和细胞，造成分离的羊膜间充质干细胞活性受损，影响后期使用。
发明内容
[0007]本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效分离纯度较高的
人羊膜间充质干细胞的方法。
[0008]为此，本发明提供了以下技术方案。
[0009]一种人羊膜间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤：
[0010](1)采集人胎盘组织并分离羊膜组织，清洗血迹；
[0011](2)将所述羊膜组织剪碎，加入第一组织消化液进行消化；
[0012](3)消化结束后去除第一组织消化液，清洗所述羊膜组织再剪碎，加入第二组织消化液进行消化；
[0013](4)消化结束后加入胰蛋白酶液进行消化；
[0014](5)加入终止液终止消化，过滤去除未消化完全的组织块，收集细胞悬液离心；[0015](6)去除上清液，加入DMEM清洗沉淀，再次离心，得到分离后的人羊膜组织间充质干细胞。
[0016]优选地，第一组织消化液包括DMEM、以及基于DMEM体积10mg/ml的中性蛋白酶和1mg/ml的DNA酶。
[0017]优选地，第二组织消化液包括DMEM、基于DMEM体积3mg/ml的I型胶原酶和0.3mg/ml 的DNA酶。
[0018]优选地，所述步骤(2)中，羊膜组织与第一组织消化液的体积比为1:1。
[0019]优选地，所述步骤(3)中，第二组织消化液的体积与羊膜组织的体积相同。[0020]优选地，所述步骤(4)中，胰蛋白酶液的体积与第二组织消化液的体积相同。[0021]优选地，胰蛋白酶液的浓度为0.05％(质量体积比)。
[0022]优选地，所述步骤(5)中，终止液的体积与胰蛋白酶液的体积相同。
[0023]一种人羊膜间充质干细胞培养及纯化方法，其中按上述分离方法得到人羊膜组织间充质干细胞后，使用选择性培养基进行细胞培养。
[0024]优选地，所述选择性培养基包括无血清培养基、以及基于所述无血清培养基体积15ng/ml的bFGF和10ng/ml的HGF。
[0025]羊膜组织中的基底层是上皮层和皮下层的连接部分，类似于皮肤组织中连接表皮层和真皮层的基底层，中性蛋白酶性能温和，能有效的消化基底层中的桥粒和锚丝成分，使上皮层和皮下层分离，再通过清洗手段可以去除上皮层，从而去除绝大部分上皮细胞，同时避免了使用胰蛋白酶消化给皮下层细胞造成的损伤。
[0026]本发明通过调整消化酶的配方分离大部分羊膜上皮细胞，还可通过使用选择性培养基的方法提高羊膜间充质干细胞的生长速度，使羊膜间充质干细胞具有生长优势，经过2-3次传代后得到纯化的羊膜间充质干细胞。
附图说明
[0027]图1是P0代羊膜间充质干细胞的照片。
[0028]图2是P3代羊膜间充质干细胞的照片。
[0029]图3是P3代羊膜间充质干细胞流式检测结果。
具体实施方式
[0030]下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于
以下实施例。
[0031]分离、培养并纯化人羊膜间充质干细胞，步骤如下：
[0032]1、医院采集足月剖腹产人胎儿胎盘组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护胎盘组织生物学活性，组织保护液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染；
[0033]2、无菌实验室中分离羊膜组织，预冷的组织清洗液清洗羊膜组织2-3次，将组织上粘黏的血迹清洗干净，使羊膜组织呈半透明状，组织清洗液由生理盐水添加按生理盐水体积计25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制；
[0034]3、将羊膜组织剪成大块组织，加入与羊膜组织等体积的组织消化液I于4℃消化过夜(8-12h)，组织消化液I配方如下：DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜氏改良Eagle培养基)、10mg/ml
中性蛋白酶(基于DMEM的体积)、1mg/mlDNA酶(基于DMEM的体积)；[0035]4、消化结束后去除组织消化液I，并用预冷的组织清洗液(配方同步骤2)清洗2-3次；
[0036]5、将洗净的羊膜组织剪碎后置于50ml离心管中，加入与羊膜组织等体积的组织消化液II，37℃震荡消化1小时，转速为150r/min，组织消化酶II配方如下：DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜氏改良Eagle培养基)、3mg/mlI型胶原酶(基于DMEM的体积)、0.3mg/mlDNA酶(基于DMEM的体积)；夹筋铝箔
[0037]6、消化1小时后直接加入质量体积比为0.05％的胰蛋白酶消化液(羊膜组织、组织消化液II和胰蛋白酶液的体积比为1：1：1)震荡消化15分钟直至绝大部分组织被消化完全，转速为150r/min；
[0038]7、加入与胰蛋白酶等体积的终止液(友康恒业生物科技(北京)有限公司，胰蛋白酶抑制剂，产品货号：NC1003)终止消化，过100μm滤网，去除未消化完全的组织块，收集细胞悬液离心，去除上清液(转速：1000r/min，时间：5分钟)；
[0039]8、加入40ml DMEM清洗沉淀，再次离心(转速：1000r/min，时间：5分钟)，去除上清液；
[0040]9、加入间充质干细胞选择性培养基进行正常培养间充质干细胞，选择性培养基配方如下：无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)、15ng/mlbFGF(基于无血清培养基的体积)、10ng/mlHGF(基于无血清培养基的体积)；
[0041]10、间充质干细胞原代培养7-10天达到融合度80％进行传代培养，其后每3天传代一次，传代比例为1：4。
[0042]间充质干细胞是具有成纤维细胞特性的细胞，在成纤维细胞生长因子的刺激下可以快速增殖，通过扩大羊膜间充质干细胞和羊膜上皮的增殖速度来使羊膜间充质干细胞活到生长优势，如图1和图2所示，经过2-3次传代培养后可以得到高纯度的羊膜间充质干细胞，相比现有的分离纯化方法更简单有效，而且对细胞活性无任何影响，有利于羊膜间充质干细胞扩增及后期临床应用。
[0043]羊膜间充质干细胞纯度检测
[0044]取P3(第三代)的羊膜间充质干细胞做流式检测进行表面标记物分析，检测CD73、
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