肝星状细胞（ hepatic stellate cells,HSCs ）分离培养及鉴定的试验方案 【试验原理】 在用循环灌注法去除肝胶原组织后，根据HS（内含富含脂滴，密度较轻，它与 肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理 , 采用密度梯度离 心方法（连续性和非连续性两种）使导电铝箔泡棉
HS存在于一高度提纯的区带中而得以分离。 【试验动物】 雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心，合格证号：）, 体重400〜500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCS前2周每天Vitamin A以 200IU/100g 灌胃。
【试剂与仪器 】 主要试剂
W型胶原酶、链霉蛋白酶（Pronase E）、Nycodenz均为美国Sigma公司产 品,DNA酶l（Dnase I）、DME培养干粉（高糖型）为Gibco公司产品,鼠抗人Desmin 抗体SP式剂盒为福州迈新生物工程公司产品，其它试剂均为国产分析纯试剂。 主要仪器设备
蠕动恒流泵、超净工作台 （2 台） 、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化 碳培养箱、多功能动物手术台等。
【试验方法】
血栓疏通机器是真的吗
1、肝星状细胞的分离制备
1） 肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12〜16h,自由 饮水。
2） 用 1％钠 40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。
3） 胸腹部皮肤消毒 , 移入超净工作台中。沿腹部正中线剪开腹腔 , 分离下腔静 脉及门静脉，在门静脉距肝外10m处用眼科剪斜形剪一小口，迅速插入自制 血管插管,结扎固定。
4） 接通恒流蠕动泵,灌注预热37C的D-Hank' s肝脏灌流液,剪开下腔静脉，此 时可见灌流液自下腔静脉流出 , 肝脏逐渐饱满 , 由紫红逐渐变成淡黄白 。
5） 游离肝脏 , 保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。 将游离之肝脏置 于平皿中,灌注预热37°C的含酶Hank' s液I（含％的胶原酶、％链霉蛋白酶 溶液并调 PH , 并将灌注系统进液端放入平皿中 , 使流出的酶液可进行循环灌 流, 可见肝脏变软无弹性 , 肝包膜下出现小液泡。
6） 倒除灌流液，撕去肝脏外膜，撕碎或剪碎肝组织,加入预热37 C的含酶
Hank' S液 H （含％的胶原酶、％链霉蛋白酶、％ DNA#I溶液并调PH ,再次 消化20mi n。
变电箱7） 经200目滤网过滤，用磨锤轻轻研磨，并用4C的Hank' S液冲冼。
8） 将烧杯内细胞悬液分装入2只50 ml的刻度离心管,550r/min 离心8min；吸 除上清入2只50 ml的刻度离心管,1750 r/min 离心8min。去上清，用炭化4C的 Hank' S液冲冼重悬,2管合1定容至10 ml。
9） 加入20 ml的18% Nycodenz,将细胞悬液分装入6只10 ml带盖的刻度离心管 中，每管液面覆盖2〜真空脱蜡炉3 ml的Hank' S液 ,3200 r/min 离心15 min。吸取中间 细胞悬液层入50 ml刻度离心管，加入无血清DME培养液至50 ml,550 r/min 离心 8 min, 取沉淀。
10） 加入预热37C的含血清的DME完全培养基至10ml。
2、 肝星状细胞的鉴定
1）光镜下观察新分离的肝星状细胞含有丰富的脂滴 , 细胞透光度增加。
2） 维生素A自发荧光鉴定：荧光显微镜下观察，在328 Bin波长的紫外光激发下 新分离
的肝星状细胞能发出蓝绿的自发荧光 , 但在数秒内迅速减退。
3） 新鲜肝星状细胞产量测定倒置相差显微镜下 , 使用血细胞计数板计数肝星状 细胞产量。
4） 肝星状细胞活力的鉴定常规台盼蓝拒染法
5） 免疫组织化学（简称免疫组化）法鉴定Desmin阳性的细胞：用鼠抗人Desmin 抗体,SP法做免疫细胞化学染。
3、 肝星状细胞纯度的鉴定：
倒置显微镜下于细胞片上随机数200个细胞,计数Desmin染胞浆黄的细胞 并计算纯度。肝星状细胞纯度（％ ）=Desmin阳性的细胞/细胞总数x 100%。
4、 肝星状细胞的培养
1 ）原代培养
用含20% （体积分数）胎牛血清的DME完全培养基稀释细胞悬液，留取少量的 细胞进行细胞纯度及活力鉴定。以1x 105〜1 x 106ml的密度接种到50ml塑料培 养瓶中，在37°C、体积分数为5% co：、95上路床%潮湿空气的C02恒温培养箱里培养。 培养瓶内细胞24 h后首次换新鲜DME培养液，以后每3 d换液1次,培养液改为含 10%胎牛血清的DME完全培养基。
2）传代培养
原代培养星状细胞长满单层后，吸去培养基,0 • 25%胰蛋白酶于37C消化 10〜15 min 。等细胞附着松动 , 显微镜下观察细胞质边缘卷起 , 间隔加大 , 便终止 消化。吸去胰蛋白酶,用Hanks液清洗1次。加入3 ml DMEM,反复吹打培养瓶壁制 成单个细胞悬液，收集细胞悬液,1 500 r - min离心10 min,离心2次后加入含10% 胎牛血清的DME重悬,以2 X 10 5个/ml浓度。
注意事项
（1） 灌注速度要恒定在10ml/min，防止血栓的形成，影响以后的消化。
（2） 灌注液的PH要准确控制在PH，减轻对HSC勺损伤。
（3） 实验过程中温度最好都在4 C为宜，特别是离心的过程要在低温下进行。
（ 4）整个过程需要熟练，否则分离过程延长，细胞活力差。整个过程以不超过 3 小时。
（ 5）整个操作过程最好都在无菌的条件下进行，减少污染，提高得率。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议