动物营养学报２０１９，３１（５）：２２７８⁃２２８６ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ
㊀
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１９．０５．０３４
刘倚帆１，２，３，４㊀谭秀文１，２，３，４㊀游㊀伟１，２，３，４㊀张相伦１，２，３，４㊀姜富贵１，２，３，４㊀
宋恩亮１，２，３，４㊀万发春１，２，３，４∗
（１．山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南２５０１００；２．山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南２５０１００；
３．山东省肉牛生产性能测定中心，济南２５０１００；４．山东省畜禽健康养殖工程技术中心，济南２５０１００）
摘㊀要：本试验旨在建立肉用杂交犊牛小肠上皮细胞分离培养和鉴定的方法，为研究犊牛小肠上皮细胞营养吸收㊁免疫调控及肠道屏障功能提供原代细胞培养模型㊂选用新生未吮乳的肉用杂交犊牛的空肠组织，应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法对小肠上皮细胞进行分离，应用相差消化法和相差贴壁法对犊牛小肠上皮细胞进行纯化㊂通过细胞形态学观察㊁生长曲线㊁免疫荧光及染体核型分析等方法来鉴定细胞㊂结果表明：１）应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法得到的犊牛小肠上皮细胞生长状况良好，经纯化后得到９０％以上纯度的犊牛小肠上皮细胞，并稳定传代至１０代以上；２）犊牛小肠上皮细胞的生长曲线为 Ｓ 形，符合细胞增殖规律；３）免疫荧光鉴定犊牛小肠上皮细胞特异性表达角蛋白１３和绒毛蛋白；４）透射电镜观察发现犊牛小肠上皮细胞边缘有微绒毛结构，细胞与细胞之间的紧密连接结构清晰可见；５）染体核型分析显示细胞内含有６０条染体，形态正常，呈二倍体核型㊂综上所述，应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化及相差贴壁纯化成功得到犊牛小肠上皮细胞，为研究犊牛小肠上皮细胞营养物质吸收㊁免疫调控和肠道屏障功能提供了细胞素材㊂ 关键词：犊牛；小肠上皮细胞；联合消化法；细胞鉴定；核型分析
薄膜印刷中图分类号：Ｓ８２３㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１９）０５⁃２２７８⁃０９收稿日期：２０１８－１０－０９
基金项目：国家自然科学基金项目（３１５０１９７９，３１６７２４５０）；现代农业（肉牛牦牛）
电厂脱硫滤布产业技术体系建设专项（ＣＡＲＳ⁃３７）作者简介：刘倚帆（１９８４ ），女，山东济南人，助理研究员，博士，从事动物营养与免疫研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｙｆｅｎｊｏｙ＠１６３．ｃｏｍ∗通信作者：万发春，研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗａｎｆｃ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
㊀㊀肠道上皮具有复杂的功能，既能在调控外源物质如细菌的侵袭过程中提供屏障作用，同时也是体内最重要的营养吸收和转运营养因子场所［１］㊂肠道上皮细胞形成的屏障能够将肠腔中有害物质从间质中隔离出来，在生理和病理条件下对维持肠道完整性和系统稳态具有重要作用［２］㊂目前，关于小肠上皮细胞的分离培养在人［３］㊁禽［４］㊁猪［５］㊁鼠［６］㊁羊［７］㊁兔［８］上均有报道，国外已有学者成功建立了猪的永生化肠道上皮细胞系，
包括来源于成年公猪回肠的ＩＰＩ⁃２Ｉ以及来源于未吃初乳的乳猪空肠的ＩＰＥＣ⁃Ｊ２和ＩＰＥＣ⁃１［９］㊂尽管国内外已有关于牛的肠道上皮细胞分离培养的报
道，但多是利用成年牛肠道组织，分离得到的细胞活力低且增殖速度慢；并且，在分离方法上多是利用组织块培养法进行，杂细胞较多，纯化难度大［１０－１１］㊂另外，在细胞鉴定方面主要是通过鉴定细胞角蛋白，但有研究表明，角蛋白不仅在上皮组织类型细胞中表达，在其他处于分化状态的细胞中也有表达［１２－１３］，因此不能仅仅通过细胞角蛋白验证分离细胞源于小肠上皮细胞㊂本试验在参照国内外方法的基础上，使用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法分离刚出生未吮乳犊牛的小肠上皮细胞，并对获得的原代细胞进行纯化和多种方法联合鉴定，以此来探索牛肠道上皮细胞简便可行的
５期刘倚帆等：肉用杂交犊牛小肠上皮细胞的分离培养和鉴定
分离纯化方法及准确有效的鉴定方法，为国内外相关领域的研究提供基础的技术平台，并为营养物质吸收㊁免疫调控㊁肠道屏障功能的研究提供有效的细胞模型㊂
１㊀材料与方法
１．１㊀试验材料
㊀㊀刚出生未吸吮母乳的利鲁牛犊牛，注射过量的钠处以安乐死后，选取空肠中段将两端结扎，用无菌剪刀剪下，放入含有１％青霉素和链霉素（购自Ｓｉｇｍａ公司）的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）中冰浴保存，２ｈ内带回实验室，备用㊂试验得到山东省农业科学院动物保护和使用委员会的许可（ＩＡＣＵＣ２００６０１０１），并符合相关试验动物福利的规则和制度㊂
１．２㊀试验方法
１．２．１㊀犊牛小肠上皮细胞的原代培养
㊀㊀在实验室超净台内无菌取出犊牛空肠肠段，放入含有１％青霉素和链霉素的ＰＢＳ中清洗数次，尽量剔除脂肪组织和肠系膜，在Ｌｏｒｅｔ［１４］㊁Ｆöｌｌｍａｎｎ等［１１］分离培养方法的
基础上进行改良㊂将组织移至另一灭菌的培养皿中，用ＰＢＳ再次清洗，直至上清液清亮㊂用眼科剪刀纵向剖开肠管，用ＰＢＳ清洗５ ６次去除内容物，将肠段剪成１ｃｍ２左右的组织块，再用ＰＢＳ清洗数次至上清液变澄清㊂静置１０ｍｉｎ，去除ＰＢＳ，转移至无菌烧杯中，加入体积比为１ʒ１的０．１μｇ／ｍＬ中性酶和３００Ｕ／ｍＬⅠ型胶原酶（均购自Ｓｉｇｍａ公司）混合液，在３７ħ㊁低速（１００ｒ／ｍｉｎ）下磁力搅拌消化组织块㊂消化１ｈ后吸取消化液上层，未消化部分加入上述消化酶继续消化１ｈ，将前后２次消化的组织液放入５０ｍＬ离心管中，３００ˑｇ离心５ｍｉｎ，离心后弃掉上清液㊂再用ＰＢＳ和ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基（购自Ｇｉｂｃｏ公司）分别清洗１遍，直至上清液澄清㊂此时显微镜下可见大量隐窝，用含１０％胎牛血清（购自Ｇｉｂｃｏ公司）的ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培养基悬浮隐窝并接种至Ｔ２５培养瓶（购自Ｎｕｎｃ公司）中，３７ħ㊁５％ＣＯ２条件下培养４８ｈ后更换培养液，以后每２ ３ｄ更换１次培养液㊂１．２．２㊀犊牛小肠上皮细胞的纯化和传代
㊀㊀培养４８ｈ后显微镜下可见小肠上皮细胞集落，同时有大量成纤维细胞，利用差速消化法可以使成纤维细胞脱落［１５］，肠上皮细胞纯度可达９０％以上㊂具体操作如下：培养瓶中加入胰酶－乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）（购自Ｇｉｂｃｏ公司）混合溶液２ｍＬ
（其中含０．２５％胰蛋白酶，０．５３ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ），消化３ｍｉｎ，在倒置相差显微镜下观察细胞皱缩和发亮的程度，当成纤维细胞收缩变圆后立即加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ
１２培养基终止消化，此时犊牛小肠上皮细胞仍然贴壁㊂用无菌玻璃管吸弃终止的消化液，再用ＰＢＳ轻轻冲洗培养瓶瓶底２ ３次，重新加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基继续培养㊂４８ｈ后，显微镜下观察仍有少量成纤维细胞，利用上述方法再次进行纯化，直至显微镜下的视野中大部分为上皮细胞为止㊂将贴壁的上皮细胞用ＰＢＳ清洗３次，加入１ｍＬ０．０５％胰酶－ＥＤＴＡ消化液，３７ħ培养箱内放置１ ２ｍｉｎ，至大部分细胞变圆㊁发亮时，加入２ｍＬ完全培养基终止消化，吹打并悬浮细胞，台盼蓝染计数活细胞，调整细胞密度为０．２ˑ１０４ ０．５ˑ１０４个／ｍＬ，种植至新的培养瓶进行传代㊂１．２．３㊀犊牛小肠上皮细胞生长曲线的测定
㊀㊀待第３代犊牛小肠上皮细胞融合达９０％以上时，将细胞消化下来后按６ˑ１０５个／ｍＬ的密度接种至９６孔培养板内培养，此后每隔２４ｈ取８孔，每孔加入１０μＬ细胞增殖剂ＷＳＴ⁃１［１６］（购自Ｒｏｃｈｅ公司），静置培养４ｈ㊂将９６孔培养板置于振荡器上振荡１ｍｉｎ，用酶标仪（ＢｉｏｔｅｋＥＬｘ８０８，Ｂｉｏｔｅｋ公司）测定各孔在４５０ｎｍ下的吸光度（ＯＤ）值，并取８孔所测的平均值，连续测定９ｄ㊂以时间为横轴，细胞孔测定ＯＤ平均值与空白孔测定ＯＤ平均值之差为纵轴绘制细胞生长曲线㊂１．２．４㊀犊牛小肠上皮细胞的鉴定
㊀㊀免疫荧光鉴定：将细胞按１ˑ１０６个／ｍＬ接种到含载玻片的激光共聚焦用平皿中，待融合至９０％，用ＰＢＳ清洗２ ３次，加入固定液多聚甲醛，４ħ处理２０ ３０ｍｉｎ㊂将多聚甲醛去除，加入预冷的ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ㊂加入含０．５％聚乙二醇辛基苯基醚（ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１０
０，购自Ａｌｌａｄｉｎ公司）的ＰＢＳ（ＰＢＳ⁃Ｔ），在冰上将细胞膜穿刺１０ｍｉｎ㊂去除ＰＢＳ⁃Ｔ，加入预冷的ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ㊂加入含３％牛血清白蛋白（ＢＳＡ，购自Ｓｉｇｍａ公司）的ＰＢＳ，常温封闭３０ｍｉｎ㊂将细胞角蛋白１３（ＣＫ１３）㊁波形蛋白（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）㊁绒毛蛋白（ｖｉｌｌｉｎ）单克隆抗体（购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）分别按照１ʒ１００的比例稀释在含１％ＢＳＡ的ＰＢＳ中，去除封
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㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷
闭液后，加入一抗，４ħ孵育过夜㊂去除一抗，加入含０．３５％吐温２０的ＰＢＳ，洗３次，每次５ｍｉｎ㊂将荧光二抗ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８羊抗兔（Ｈ＋Ｌ）免疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧ）（购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）按照１ʒ４００比例稀释在含１％ＢＳＡ的ＰＢＳ中，去除ＰＢＳ后，加入二抗，室温避光孵育１ｈ㊂去除二抗，加入含０．３５％吐温２０的ＰＢＳ，洗３次，每次５ｍｉｎ㊂加入１００ｎｇ／ｍＬ荧光染料４ ，６－二脒基－２－苯基吲哚（ＤＡＰＩ），室温避光孵育１０ｍｉｎ㊂去除ＤＡＰＩ，加入含０．３５％吐温２０的ＰＢＳ，洗３次，每次５ｍｉｎ㊂加入防荧光淬灭溶液，用激光共聚焦显微镜（ＮｉｋｏｎＥＣＬＩＰＳＥＴｉ，日本Ｎｉｋｏｎ株式会社）
观察拍照㊂㊀㊀电镜检查鉴定：对原代培养细胞进行透射电镜观察，将细胞按照１ˑ１０６个／ｍＬ接种到转移小室（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）中，待９０％融合后，ＰＢＳ清洗２次，加入２．５％戊二醛，４ħ固定过夜，按照透射电镜（ＭｏｄｅｌＪＥＭ⁃１２３０，日本ＪＥＯＬ株式会社）制作程序观察㊁拍片㊂
１．２．５㊀犊牛小肠上皮细胞二倍体核型分析㊀㊀根据詹康等［１５］㊁王治国等［１７］染体核型分析方法，取第５代犊牛小肠上皮细胞，加秋水仙素到培养液中至终浓度为０．０５μｇ／ｍＬ，在３７ħ培养箱中继续培养３ ４ｈ，大部分处于细胞分裂中期㊂胰蛋白酶消化分离细胞后转入１５ｍＬ离心管，４ħ下５６０ˑｇ离心３ｍｉｎ收集细胞㊂吸去上清液加入预
热至３７ħ的０．０７５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾（ＫＣｌ）溶液７ｍＬ，轻轻吹打均匀，３７ħ培养箱中温育１７ｍｉｎ㊂悬液中加入新鲜固定液１ｍＬ，轻轻吹打混匀㊂将悬液以７８０ˑｇ离心１０ｍｉｎ去上清㊂加入新鲜固定液７ｍＬ吹打混匀，室温静置３０ｍｉｎ，７８０ˑｇ离心１０ｍｉｎ弃上清液，重复上个步骤１次㊂视细胞量加入固定液０．５ｍＬ，吹打均匀㊂取出预冷的载玻片，将载玻片倾斜４５ʎ，在载玻片上方用吸管迅速滴上２ ３滴细胞悬液，用嘴轻轻吹散使细胞分散均匀，室温干燥㊂吉姆萨（Ｇｉｅｍｓａ）工作液染１５ｍｉｎ，冲洗，空气干燥㊂先用低倍镜寻良好的分裂相，再使用高倍镜观察㊂
２㊀结㊀果
扣具２．１㊀犊牛小肠上皮细胞的分离培养及纯化㊀㊀经消化酶消化下来的多为肠隐窝器官样单位㊁部分细胞团和少量单细胞，细胞贴壁能力强，生长良好㊂在倒置显微镜下观察，可见培养的细胞在１ ２ｄ内贴壁，培养４ ６ｄ可见明显增殖，培养８ ９ｄ汇成一片（图１），此时可见肠上皮细胞典型的生长特征：单层生长不重叠，呈多角形或鹅卵石样，铺路石状排列㊂利用差速离心法纯化小肠上皮细胞，细胞生长状态良好，分裂旺盛，界限清晰，可铺满瓶底，并得到较纯的犊牛小肠上皮细胞加密存储
㊂
㊀㊀Ａ：培养１ｄ；Ｂ：培养４ｄ；Ｃ：培养８ｄ㊂
㊀㊀Ａ：ｃｕｌｔｕｒｅｄａｆｔｅｒ１ｄ；Ｂ：ｃｕｌｔｕｒｅｄａｆｔｅｒ４ｄ；Ｃ：ｃｕｌｔｕｒｅｄａｆｔｅｒ８ｄ．
图１㊀培养不同时间的犊牛小肠上皮细胞
Ｆｉｇ．１㊀Ｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ（１００ˑ）
２．２㊀犊牛小肠上皮细胞生长曲线的测定
㊀㊀由图２可知，第１ ４天细胞生长缓慢，第６ １０天细胞处于对数生长期，增殖旺盛，第１１ １２天细胞达到平台期，１１ｄ之后细胞增殖减缓㊂可以看出细胞生长曲线为 Ｓ 形，符合细胞生长的一
般规律㊂
２．３㊀犊牛小肠上皮细胞的鉴定
㊀㊀本试验选择在小肠上皮细胞中特异性表达的细胞角蛋白１３和绒毛蛋白，以及在成纤维细胞中特异性表达的波形蛋白㊂由图３可知，在小肠上
０
８２２
５期刘倚帆等：肉用杂交犊牛小肠上皮细胞的分离培养和鉴定皮细胞中特异性表达的角蛋白１３和绒毛蛋白呈阳性表达，而在成纤维细胞中特异性表达的波形蛋白也呈阳性表达
㊂
图２㊀犊牛小肠上皮细胞生长曲线
Ｆｉｇ．２㊀Ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ
㊀㊀透射电镜观察（图４）显示细胞形态完整，并观察到小肠黏膜上皮细胞的标志性结构如微绒毛㊁紧密接连结构等，其中微绒毛排列致密，紧密连接复合体与桥粒结构明显，表明分离得到的细胞为肠道上皮细胞㊂
２．４㊀犊牛小肠上皮细胞核型分析
㊀㊀对传至第５代的犊牛小肠上皮细胞进行染体核型分析，由图５可知，第５代的犊牛小肠上皮细胞染体数为６０条，其核型与哺乳动物细胞染体图谱一致，进一步表明传至第５代的犊牛小肠上皮细胞具有稳定的生物学功能㊂
３㊀讨㊀论
㊀㊀小肠上皮细胞是犊牛体内最重要的营养吸收和转运营养因子的场所，对犊牛肠道微生物调控以及作为肠道免疫屏障都发挥重要作用［１８］㊂目前犊牛腹泻等胃肠道疾病的发生导致养殖业经济和
社会的损失不断加大，而这些疾病的发生和肠道屏障功能的丧失有密切联系［１９］㊂位于消化管内壁的肠上皮是肠道屏障的重要组成部分，通过与成纤维细胞㊁细胞外基质之间的相互作用来维持自身的平衡㊂但这个平衡系统在离体组织样品中很脆弱，因组织突然供血不良㊁温度调节失衡㊁细胞和细胞㊁细胞和细胞外基质的相互作用也会紊乱㊂这种紊乱会导致上皮细胞出现失巢凋亡现象［２０］，这也是肠上皮细胞原代培养很难获得成功的主要原因
㊂
㊀㊀Ｎｕｃｅｌｕｓ：细胞核；ＣＫ⁃１３：细胞角蛋白１３ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１３；Ｖｉｌｌｉｎ：绒毛蛋白；Ｖｉｍｅｎｔｉｎ：波形蛋白；Ｍｅｒｇｅ：融合㊂
图３㊀犊牛小肠上皮细胞的免疫荧光鉴定
Ｆｉｇ．３㊀Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ（２００ˑ）
１
８２２
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动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１
卷
㊀㊀Ａ：箭头所指为微绒毛；Ｂ：箭头所指为紧密连接结构㊂
㊀㊀Ａ：ａｒｒｏｗｈｅａｄｉｎｇｔｏｍｉｃｒｏｖｉｌｌｕｓ；Ｂ：ａｒｒｏｗｈｅａｄｉｎｇｔｏｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎ．
图４㊀犊牛小肠上皮细胞的透射电镜鉴定
Ｆｉｇ．４㊀Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓ
图５㊀犊牛小肠上皮细胞核型分析
金桥通联轴器Ｆｉｇ．５㊀Ｋａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ（１０００ˑ）
３．１㊀犊牛小肠上皮细胞的原代培养
㊀㊀目前小肠上皮细胞的分离方法主要有组织块
培养法㊁非酶消化法（螯合或解聚溶液）和酶消化
法［２１］㊂利用组织培养细胞首先容易导致细菌污染，因为肠道是一个开放的组织，具有很多条件致
病菌，仅靠清洗难以完全去除㊂另外，抗生素的大
量使用，使肠道内细菌产生一定的耐药性［２２－２３］，所以即使在培养基中加入双抗也很难抑制细菌生长繁殖㊂同时，高浓度抗生素的使用也会影响原代培养细胞的形态及功能［２４］㊂因此，本
试验选择利用酶消化法分离小肠上皮细胞，而且选用的是出生１２ｈ内未吮乳的新生犊牛，此时的犊牛未采食，可避免源头污染，且小肠上皮细胞生长迅速，增殖能力强㊂我们也尝试了从出栏母牛小肠中分离细胞进行培养，但与刚出生未吮乳的犊牛相比出现污染的几率较大，分离得到的细胞量少且活力低，过早出现拉丝结网等凋亡现象㊂
㊀㊀在利用酶消化法分离细胞时应尽量选择对细胞损伤小的消化酶，研究表明，使用胰蛋白酶仅能
获得少量肠绒毛隐窝单位和单个细胞，细胞贴壁
和生长能力较弱㊂而联合使用胶原酶（Ⅺ型）和中
性蛋白酶（Ⅰ型）㊁多次（短时间）快速消化收获细
胞法可获得大量健全肠绒毛隐窝单位和单个细
胞［２５］㊂利用嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分
离和培养［２６］㊂尹博文等［２７］㊁Ｇｒａｖｅｓ等［２８］采用胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ及二硫苏糖醇（ＤＴＴ）联合消化法，成功分离得到树鼩㊁人和小鼠的小肠上皮细胞，同时研究发现消化２ ３ｈ得到的细胞从数量到活力上来说是相对比较好的㊂本试验参考上述消化法，采用Ⅰ型胶原酶和中性
蛋白酶联合消化，并增加了磁力搅拌的步骤，３７ħ㊁低速（１００ｒ／ｍｉｎ）下磁力搅拌消化组织块，既缩短了消化作用时间㊁减轻了酶对细胞的毒性损害，又能使得消化更为充分完全㊂
㊀㊀肠道上皮细胞原代培养很难获得成功的一个
关键因素是杂细胞污染，主要是成纤维细胞的污
染，且随着培养时间的延长，成纤维细胞的比例会
越来越大，而上皮细胞的生长则受到较大抑制㊂
本试验利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的
敏感性不同以及贴壁速度不同而采用相差消化－
相差贴壁法来纯化分离得到犊牛小肠上皮细胞㊂
成纤维细胞对胰酶作用非常敏感，传代消化时往
往先脱落；而在细胞接种后，贴壁速度比上皮细胞
快㊂研究表明成纤维细胞贴壁时间为９０ｍｉｎ，而
上皮细胞贴壁时间为１２ ２４ｈ［８］㊂因此，利用２种细胞贴壁速度的差异可以在单细胞悬液接种时去除成纤维细胞㊂当胰酶可以轻松把成纤维细胞消
生态仪
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