一．发展概况
组织培养(Tissue culture)是在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下。使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代，并维持原有的结构和功能特性。广义的组织培养与体外培养同义。体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养，即：组织培养、细胞培养和器官培养。 所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。
组织培养的发展史已有近百年，最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则上，用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块，对细胞进行形态和功能的观察。
通过许多学者大的改进和革新，培养基由天然动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清。现在全世界贮存的细胞约有万种以上。组织培养不仅是细胞生物学必需的技术，也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法。
二．基本原理和方法
体外培养细胞的生存条件：
(一)营养。
体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。目前主要使用血清，以牛血清为主。血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。合成培养基中不加血清也能维持细胞生存，但不能很好生长，加入5%的血清，对大多数细胞来说，能维持细胞不死和缓慢生长，要使细胞正常生长，一般需加10～15%的小牛血清。每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每5分钟摇一次。10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。添加血清，虽利于细胞生长，但增加了不明成分，给分析实验结果带来了困难。因此，人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展。
（二）环境
1．无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物，对细菌和霉菌也是高度营养物，细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡，因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身。因此，培养室的空气等要彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌操作，各种物品拿入操作台前应消毒，用洒
精擦表面，用前于紫外线照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时禁止讲话。
2.温度：组织培养的最适温度为35-37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时死亡，温度在43℃以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响较小，细胞置于25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放在4℃数小时之后，再置37℃培养，细胞仍能继续生长。
3.气体：气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。
4.pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可产生有害的影响。各种细胞对pH值的要求也不完全相同，但总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/ CO2。细胞代谢产生的各种酸使pH下降，而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加。
5.培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大，除少数悬浮生长的细胞外，绝大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物。它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时，才能生长、生存或维持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸
泡1至7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次，烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1N HCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照射消毒；新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟，冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟，清水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压灭菌。
总之，细胞在适当的培养条件下可迅速增殖，但若遇到不良环境细胞会变圆，停止生长，甚至死亡，这是细胞的保护机制。综上所述，细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度。
三．常用的培养方法
根据培养物细胞生物学的特点，组织培养可分为原代培养和传代培养。亦可根据培养条件和器皿的不同而分为静置培养和动态培养。静置培养为最常见的方式，细胞可为贴壁型细胞，亦可为悬浮的不贴壁细胞。
（一）传代细胞的静置培养
培养细胞的观察和传代：所有体外培养细胞，包括原代培养和各种细胞系（株），当生长达到一定的密度后，都需要做传代处理。传代的频率和间隔与接种细胞的数量、细胞生物学特性以及营养性质等
有关。接种细胞多则细胞数饱和速度快；肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时，细胞增殖快。一般是在细胞长满瓶壁、营养及PH稍降低时做传代培养，依据细胞特性，将一瓶细胞1：3或1：4传代。在细胞长满时，应尽早传代，否则细胞会中毒，形态发生改变，重则从壁上脱落死亡。传代过晚（若已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态，细胞需要再传一两代，把不健康的细胞除去，才能恢复使用。
那么，怎样才能做到及时传代呢？要做到及时传代，每天要仔细观察细胞的生长情况来决定是否要换液或传代。一般是形态观察，用倒置显微镜对活细胞形态、胞浆和胞膜进行观察。生长状态良好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，看不见空泡，胞膜清晰，折光性强。培养上清液清晰透明，看不见悬浮的细胞和碎片。细胞机能不良时，胞质中常出现空泡，脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则，甚至失去原有的特点。只有状态良好的细胞才能用来做实验。一般在细胞接种或传代后，每天或至多间隔1-2天，应观察细胞形态、细胞生长、培养液PH值和污染与否等，随时掌握细胞动态变化，以便于做换液或传代处理。如发现异常情况，及时采取措施。正常情况下，培养液呈桃红，用一般温箱培养时，随细胞生长时间的延长，二氧化碳积累增多，由于培养基内有PH指示剂的存在，其颜可间接反映细胞的生长状态。呈橙黄时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄则可能是培养时间过长，营养不足，死亡细胞过多；呈紫红则可能是细胞生长状态不好或已死亡。（二）培养细胞的保存和复苏
主轴编码器
做实验前要先学会冻存，以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞，且可减少污染或其它不利影响。
1.影响冻存细胞活性的因素
（1）细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，常用的浓度为5%-10%（90%
基础桩小牛血清）。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。
（2）细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度，降至-20℃冻结。均可获得满意效果。
（3）保存温度：液氮罐，可达到-196℃，此时所有的物理化学活动均降至最低限度，以保证细胞长期保存。
（4）复苏：急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃～43℃的水浴中，30秒至一分钟内融化。
2.冻存与复苏方法
适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）。A.细胞用胰蛋白酶+EDT A消化后用冻存液稀至2～5X106/ml。B.分装于2ml冻存管中，装量1ml，封口，作好标记，用几层纱布扎好。C.冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以1℃/min的速度降温，一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。D.为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37℃～43℃水浴中，充分摇动使其急速融化，30秒至1分钟内完成。E.细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入原来使用的生长液，置37℃培养。
四．基本设备和试剂
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设备（略），环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。
基本试剂
培养液：①1640溶于新蒸的三次蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，过滤除菌即可。②小牛血清用前56℃X30分钟灭活（破坏补体）分装置-20℃保存备用。③青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解，分装冻存于-20℃，使用前融化，每100ml生长液中加1ml，即使用终浓度为含P.S 100μg/ml。（注：P.S不能冻融多次，应少量分装，一次用完）。④NaHCO3液，用于调整pH值，常用浓度为5～6%，配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌，分装4℃保存。⑤胰蛋白酶在pH 8.0，温度37℃时作用力最强（详见配方）。⑥EDTA液（详见配方）。
附：
胰酶消化液配方（500ml）
NaCL 4 g
KCL（19%）1 ml
Na2HPO4 0.126g(12H2O)
铝合金箱体
Tris 1.5g(三羟甲基氨基甲烷)
以上药物充分溶解后加水至500 ml，然后再加胰蛋白酶5g，最后用1N HCL调pH至7.7，过滤除菌分装，然后-20℃保存备用。
EDTA液配方（0.2% 1000ml）
EDTA(versene) 2 g
NaCL 8 g
KCL 0.2g
Na2HPO4(12H2O) 2.9g
KH2PO4 0.2g
以上药物同样充分溶解后，加新鲜的三蒸水至1000 ml，分装然后高压15磅30分钟灭菌，最后4℃保存备用。
细胞冻存液：小牛血清90℅与二甲基亚砜（DMSO）10℅混合; -20℃冰箱保存备用。或小牛
血清30℅，1640培养液60℅，DMSO10℅混合; - 20℃冰箱保存备用。
原代培养
组织块培养法
组织块培养是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养法。即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要适当处理。例如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。如果原代细胞准备做组织染、电镀等检查，可在做原代培养前先在培养瓶内放置小盖破片，小盖破片要清洗干净，在消毒前放置。并在放入组织块前预先用1-2滴培养液湿润瓶底，使之固定。组织块法操作简便，部分种类的组织细胞在小块贴壁培养24h后、细胞就从组织块四周游出。但由于在反
复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。组织块法特别适合于组织量少的原代培养如牙田细胞培养等。用品
(1)Hank’s液(也可用无血清培养液)，培养液
(2)培养瓶(必要时瓶内可放置小盖破片)，吸管和胶帽杯(20 rnl)或青雷素小瓶
（3)眼科剪．眼科摄，小玻璃板(8cm×5cm)。牙科探针
步骤
(1)按照培养细胞取材基本原则和方法取材、修剪，将组织剪或切成1*1*1cm左右的小块。在剪切过积中．可以适当向组织上加1-2滴培养液，以保持湿润。
(2)将切好的组织小块。用眼科镊送入培养瓶内。用牙科探针或弯头吸管将组织块在瓶壁均匀摆置，每小块间距0.5cm左右。量不要多。25m1培养瓶(底面积约为17．5cm)以20-30小块为宜。如果瓶内有盖玻片、其上也放置几块。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上．向瓶内注入适量培养该，盖好瓶盖．将培养瓶倾斜放置存37度温箱。
(3)放置2—4h待组织小块贴附后．将培养瓶慢慢翻转平放、静置培养。这过程动作要轻巧．让液体缓
缓覆盖组织小块。严禁动作过快液体产生冲力使粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。长组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。组织块培养也可不用翻转法。即在摆放组织块后。向培养瓶内加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，放入温箱培养24h再补加培养液。
2 消化培养法
这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除．使细胞分散．形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞也在短时间内生长成片。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高；
但步骤繁琐、易污染．一些消化酶价格昂贵．实验成本高。
用品
各种消化液。
步骤
(1)消化分离法收获细胞。
(2)在消化过程中，可随时吸取少量消化液在镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化。通过孔径适当的筛网，滤绰组织块。大组织块可加新的消化液后继续消化。
(3)已过滤的消化液800-100urpm低速离心5min后，去除上清，加含血清培养液，轻轻吹打形成细胞悬液。如果用胶原酶或EDTA消化液等。尚需用Hanks液或培养液洗1-2次后再加
培养液。细咆计数后，接种培养版．置CO2温箱培养。
某些特殊类型细胞如内皮细胞、骨细胞等需特殊的消化手段。对悬浮生长的细胞，如白血病细胞、骨髓细胞合胸水、腹水含有癌细胞可不经消化直接离心分离或经淋巴分离液分离后接种，进行原代培养。
器官培养
器官培养是指从供休取得器官或器官组织块后、不进行组织分离而直接在体外的一定环境中培养。保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。器官培养的目的和技术与单层细胞培养不同。可利用器官培养对器官组织的个长、变化进行休外观察，并可以通过改变外界条件研究对器官组织影响。器管培养主要强调器官组织的相对完整性，观察细胞正常联系和排列情况及它们之间的相互影响，和局部环境的生物调节作用。
器官培养的要求
(1)需要特殊的培养条件；由于离体组织没有血液系统供给养分，要维持组织细胞的生长需要。营养和氧气仅能靠自然渗透来维持。为使器官组织生长正常，中心不发生营养缺乏性坏死，组织的厚度或直径不宜超过1mm。
(2)器官组织内部细胞需要有足够的氧气渗入。一般采取两种方法：一是将器官组织块置放在培养基气液面，使其气体交换更容易；二是提高培养环境的氧分压。要根据组织类型而定，多数组织需较高氧分压，一般要加注纯氧。提高氧分压时，仍然需保持5％的CO2，以维持培养液的酸碱平衡。
不同的器官培养，尚需一些特殊的条件，如某些生长因子、激素等。
环己胺氢溴酸盐用品
除一般培养用品外还需以下器材：
(1)不锈钢筛网（用做支架)
(2)0.5um滤膜
(3)器官培养的培养皿
步骤
(1) 将不锈网做成支架形状调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5um孔径滤膜。
(2) 将培养液加入培养皿，使液面刚刚接触列滤膜。但不要使其浮起。
(3) 将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200um，水平面积不超过10*10cm，加组织为肝、肾等不能大于1*1*1mm。
(4) 将上述准备好的培养物放入CO2培养箱，并加注氧气，调整氧分压，最好到90％。
邬婧婧(5) 培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持与滤膜—致的水平上。
上述可进行器官培养1-3周．每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。
传代培养
原代培养的首次传代
原代培养后由于细胞游出数量增加和细胞的增殖、单层培养细胞相互汇合，整个板底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离
培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代，进行一次分离再培养称之为传一代。初代培养的首次传代是很重要的，是建立细胞系关键的时期。在首次传代时一般要特别注意以下几点：
(1)细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代。
(2)原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维细胞并存的情况很多见，传代时不
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