为什么要检测 DNA 甲基化？⾸先，我们为什么要检测 DNA 甲基化呢？检测 DNA 甲基化能回答什么问题？我们都知道，DNA 甲基化可以调控基因表达，因此检测 DNA 甲基化⾄少可以为解释基因表达的调控提供⼀些线索。其次，DNA 甲基化参与⼀系列重要⽣物学过程，包括早期胚胎发育、基因组印记、X 染⾊体失活、重复序列的沉默以及癌症的发⽣发展转移，DNA 甲基化也有助于阐明这些重要的⽣命过程背后隐藏的奥秘。此外，DNA 甲基化⼀个⾮常重要的应⽤，是可以作为肿瘤的⽣物标志物。DNA 甲基化如此重要，我们可能需要时刻想着它。 image
投影拼接图 1. DNA 甲基化的⼏种应⽤场景所谓知⼰知彼，百战不殆，我们还得知道我们要检测的 DNA 甲基化在⼈基因组内的基本情况。⼈类⼤约有 30亿个碱基对，DNA 主要发⽣在 CpG ⼆核苷酸上，基因组中⼤约有 2800 万个 CpG 位点。这些 CpG 位点中，⼤约 60~80% 被甲基化，⽽在⼀些特定的区域，⽐如启动⼦，存在 CpG 位点富集的序列，我们称之为 CpG 岛，CpG 岛通常未被甲基化。但是在肿瘤细胞中，整体甲基化⽔平降低⾄ 20~50%，与正常细胞相⽐，即可能有 10~60% 的 CpG 位点的甲基化状态发⽣了改变，也就是⼤约 280~1680 万个 CpG 位点。
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图 2. ⼈类基因组中 DNA 甲基化概况
位点特异性的 DNA 甲基化刚才我们介绍了总体 DNA 甲基化⽔平的检测，但是这些⽅法都没有提供序列信息。如果我们需要知道位点特异性的甲基化信息，这个时候需要问第⼆个问题，我是只检测感兴趣的⼏个基因就⾏了，还是需要知道全基因组每⼀个基因的甲基化状态。如果我们只需要检测特定基因的 DNA 甲基化状态，紧接着，我们需要问第三个问题，我们只是定性地看看甲基化状态，还是定量地看甲基化的⽔平。
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图 13. 四个问题 2.0 版本之第⼆、三个问题Methylation-specific PCR，MSP如果只是定性地看甲基化的状态，最简单快捷的是甲基化特异性的 PCR。MSP 可以快速检测 CpG 岛中任意⼀组 CpG 位点的 DNA 甲基化状态。
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图 15. MethyLight 的⼯作原理（图⽚来源：QIAGEN, EpiTect MethyLight PCR Kit）Bisulfite cloning & SequencingMSP 和MethyLight 都是简单快速的⽅法，都需要借助甲基化的引物。对于检测特定基因的甲基化，最常⽤的可能是重亚硫酸盐转化&克隆测序（Bisulfite cloning & Sequencing）。⾸先针对特定的区域设计引物，随后⽤限制性内切酶消化基因组DNA，接着⽤重亚硫酸盐处理，PCR，挑克隆测序。这⾥推荐⼀些引物设计过程中可能需要⽤到的软件或⽹址，包括如何寻 CpG 岛，如何设计甲基化的引物等。通常，结果呈现是如图 16（右下）。
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图 16. 重亚硫酸盐转化&克隆测序[7]
基于⾼通量测序的全基因组 DNA 甲基化检测⽅法接下来，我们看⼀下第四个问题的另⼀种答案，我
们⽤⾼通量测序来检测全基因组的 DNA 甲基化。之所以最后讲这个，是因为这个⽐较烧钱，⽽且后续的⽣物信息学分析⽐较复杂。WGBS & RRBS对于⼆代测序的⽅法，WGBS（Whole-Genome Bisulfite Sequencing）是⽬前的“⾦标准”。WGBS 想必⼤家都已经很熟悉了，但是考虑到 WGBS 成本较⾼，因此还有⼀种跟WGBS ⼗分相似，但是只测基因组中的⼀部分的⽅法，即 RRBS（Reduced representation bisulfite sequencing）。
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图 21. WGBS & RRBS 的⽐较[10]两者的差别在于，WGBS 通常使⽤超声打断整个基因组，并对整个基因组进⾏重亚硫酸盐处理和测序；但是RRBS 使⽤ MspI 限制性内切酶。RRBS 可以检测到⼈类基因组中 85% 的 CpG 岛。RRBS ⼤约需要 100ng-1ug 的 DNA，⽽对于 WGBS ⽽⾔，需要 50-100ng DNA。尽管 WGBS 被誉为检测 DNA 甲基化的“⾦标准”，但是依然存在很多的不⾜。⾸先，重亚硫酸盐必须转化未甲基化的 DNA，否则会造成假阳性，不过⽬前我们可以通过加⼊ spike-in 作为对照来克服这个问题；还有，⽬前测到的 DNA 甲基化是多个细胞的平均甲基化状态，单细胞的 DNA 甲基化检测可能克服这个问题；其次，重亚硫酸盐转化，会降低基因组的复杂度，造成后续的 mapping 率不⾼；重亚硫酸盐转化还可能造成 DNA 断裂，这使得扩增长⽚段⽐较困难。另外，WGBS 的成本还是⾮常⾼的。
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