唐菱;侯晓军;周剑;车坷科;支世君
【摘 要】目的 建立硫酸新霉素凝胶的微生物限度检查法,并对检查方法进行验证.方法 利用硫酸镁能与凝胶中的卡波姆结合形成镁盐沉淀达到絮凝的原理,用10％硫酸镁溶液10mL与硫酸新霉素凝胶109混匀,加0.9％无菌氯化钠溶液80mL,静置,取上清液1mL,加0.9％无菌氯化钠溶液至100mL稀释后过膜,用900mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分9次冲洗滤膜,每次100mL.结果 各试验菌的计数回收比值均在0.5～2.0,控制菌生长良好,符合《中国药典》2015年版规定.结论 该方法有效可行,可用于硫酸新霉素凝胶的微生物限度检查.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2016(041)009
【总页数】4页(P680-683)
【关键词】硫酸新霉素凝胶;微生物限度;适用性试验;薄膜过滤
【作 者】唐菱;侯晓军;周剑;车坷科;支世君
【作者单位】重庆市中医院药剂科,重庆400021;重庆市中医院药剂科,重庆400021;重庆市食品药品检验检测研究院,重庆401121;重庆市人民医院,重庆400014;重庆市中医院药剂科,重庆400021
【正文语种】中 文
【中图分类】R978.1
为了使微生物限度检查能更准确地反映药品被污染的真实状况，保障药品质量，《中国药典》2015年版对非无菌产品微生物限度检查法在培养基种类、适用性试验菌种、回收率范围等方面进行了较大修订。硫酸新霉素凝胶为本院自主研发并取得医疗机构制剂注册批件的氨基糖苷类外用凝胶剂，临床主要用于脓疱疮等感染性皮肤病。笔者根据《中国药典》2015年版四部[1]微生物限度检查法的规定，在建立硫酸新霉素凝胶微生物限度检查法过程中，发现该制剂处方中硫酸新霉素、亚硫酸氢钠、尼泊金乙酯会对微生物限度检查造成干扰，常规平皿法检查不能真实反映药品污染微生物的情况。利用10%硫酸镁与凝胶中的卡
波姆(丙烯酸交链聚合物)结合形成镁盐沉淀[2]，达到絮凝目的，取上清液，用薄膜过滤法，可以有效地去除抑菌成分，适用性试验中各类菌回收比值达到满意的效果。
1.1 供试样品
硫酸新霉素凝胶(重庆市中医院制剂室，批号：150301、150302、150303，规格：0.5%)
1.2 卡波姆凝胶基质
取25g卡波姆-940，加入1000mL纯化水中，搅拌均匀，使其充分溶胀后，缓慢滴加饱和氢氧化钠溶液，边加边搅拌，直至凝胶透明、pH6.5～7.5，玻璃瓶分装，密封，121℃高压灭菌20min，备用。
1.3 仪器设备
JW-XSW水平流超净工作台(苏州市伟业空调净化有限公司)；TK-20K/LED-A200电子天平(福州华志科学仪器有限仪器有限公司)；HTY-602集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)；FC50A脱卸式薄膜过滤器(杭州高得医疗器械有限公司)；HR40-IIA2生物安全柜(海尔 生物医疗公司)； WTWBZG-40菌落计数器(德国WTW)；SPX-150-Ⅱ生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)、PYX－DHS隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)。
1.4 试验菌株
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B)10 104]、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、白念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98 003]，菌株均购自中国食品药品检定研究院，自行传代。
1.5 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基(批号20150506)(TSA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)(批号20150506)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)(批号20150401)、甘露醇氯化钠琼脂培养基批号20150402)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号20150502)，均购自青岛日水生物技术有限公司。
1.6 试剂
硫酸镁(天津市致远化学试剂有限公司，批号：2014年4月16日)分析纯，卡波姆-940(北京市海淀会友精细化工厂，批号140908)，氢氧化钠(成都华邑药用辅料制造有限责任公司，批号20150701)。
1.7 稀释剂
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(青岛日水生物技术有限公司，批号20150401)， 0.9%无菌氯化钠溶液(四川科伦药业股份有限公司，批号：R081135)。
2.1 菌液的制备
参照《中国药典》2015年版四部附录[1]要求制备。
2.2 供试液制备
取供试品10g，置盛有灭菌玻璃珠的锥形瓶中，加入10%硫酸镁溶液10mL充分混匀，待絮状凝结，再加0.9%无菌氯化钠溶液80mL，静置，取上层清液作为1:10的供试液备用。
试验组的加菌回收比值＝(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落
数；
悬浮机器人稀释剂对照组的加菌回收比值＝稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组平均菌落数
4.1 凝胶絮凝过程中微生物回收比值试验[3]
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4.1.1 试验组
取“1.2”项下卡波姆凝胶10g，置盛有灭菌玻璃珠的锥形瓶中，加入菌悬液1mL(含菌5000～10000cfu)充分混匀，加入10%硫酸镁溶液10mL充分混匀，待絮状凝结，再加0.9%无菌氯化钠溶液80mL，静置，分取上清液1mL，注入平皿中，含需氧菌的试液倾入胰酪大豆胨琼脂培养基、含真菌的试液倾入沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后，胰酪大豆胨琼脂培养基置30℃～35℃培养72h，沙氏葡萄糖琼脂培养基置20℃～25℃培养120h。观察，测定所加的试验菌数。
4.1.2 菌液对照组
取菌悬液1mL(含菌5000～10000cfu)，加入0.9%无菌氯化钠溶液至100mL，混匀，取1mL，注入平皿中，同试验组方法倾入培养基进行培养。
4.1.3 供试品对照组
按“4.1.1试验组”的方法和条件测定不加菌悬液下卡波姆凝胶基质的本底菌数。
4.1.4 结果
金属粘合剂表1结果可知，试验组的回收比值均在0.5～2之间，说明供试液制备过程中微生物几乎没有受到影响。
4.2 薄膜过滤法微生物回收比值考察
4.2.1 试验组
取1:10的供试液1mL，加入0.9%无菌氯化钠溶液至100mL，混匀，过滤。分别用300、600和900mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100mL，边冲洗边振摇，泵速为120r/min，在最后一次冲洗液中平行加入铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌、黑曲霉的菌悬液各1mL(含菌50～100cfu)，混匀。冲洗完毕取出滤膜菌面朝上，分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，每种菌平行制备2张滤膜，铜绿假单胞菌、
金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌置30℃～35℃培养72h。白念珠菌、黑曲霉置30℃～35℃培养120h。
取1:10的供试液1mL，加入0.9%无菌氯化钠溶液至100mL，混匀，过滤。分别用300、600和900mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100mL，边冲洗边振摇，泵速为120r/min，在最后一次冲洗液中平行加入白念珠菌、黑曲霉的菌悬液各1mL(含菌50～100cfu )，混匀。冲洗完毕取出滤膜菌面朝上，分别贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，每种菌平行制备2张滤膜，置20～25℃培养120h。CC数据
4.2.2 供试品对照组
取1:10的供试液1mL，以稀释液代替菌液，照“4.2.1”试验组方法操作。
4.2.3 菌液对照组
照“4.1.2”试验组方法操作。
4.2.4 稀释剂对照组
取0.9%无菌氯化钠溶液89mL，加10%硫酸镁10mL，分别加入铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌、黑曲霉5种菌的菌悬液1mL(含菌5000～10000cfu)，混匀。照“4.2.1”试验组方法操作。空调铝箔
4.2.5 结果
表2～4可见，供试液1mL稀释后过膜，用300、600和900mL冲洗剂冲洗可使虽铜绿假单胞菌、白念珠菌、黑曲霉回收比值达0.5～2，但300和600mL冲洗金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收比值均小于0.5，说明600mL及以下体积冲洗是不能消除硫酸新霉素凝胶对金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用。900mL冲洗金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收比值达0.5～2。说明该试验方法适用于硫酸新霉素凝胶的微生物限度检查。euht终端
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