杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤
【摘 要】目的 解读2015年版《中国药典》无菌检查法的主要增修订情况.方法 对比2015年版《中国药典》无菌检查法与2010年版《中国药典》无菌检查法的主要差异.结果 2015年版《中国药典》无菌检查法在检查内容、检查方法、培养体系及质量控制理念等方面都作了较大修订.结论 2015年版《中国药典》将无菌检查法完善成为更加科学并与国际接轨的检查方法. 【期刊名称】《中国药业》
【年(卷),期】2015(024)024
smdao【总页数】5页(P7-11)
【关键词】无菌检查法;2015年版《中国药典》;无菌药品;培养体系;质量控制
清理平台【作 者】射频开关芯片杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤
【作者单位】陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;上海市食品药品检验所,上海 201203;中国食品药品检定研究院,北京 100050
【正文语种】中 文
【中图分类】R954;R921.2
无菌检查法是指用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的方法［1］，是药品微生物检查体系的重要组成部分，药品微生物是关系药品安全性的关键指标之一。无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发临床不良事件的主要因素，近年来发生的“欣弗事件及刺五加事件”等严重药害事件都是无菌药品的微生物污染导致［2］。目前，美国、欧盟、日本等国家或组织无菌检查法已协调一致［3］。2010年版《中国药典》及之前版本收录的无菌检查法与国际通用的标准在检查理念、培养体系、方法要求等诸多方面有显著差异。在国家药品安全规划与标准提高的目标下，2015年版《中国药典》借鉴国外药典先进技术经验，以新的控制理念为指导，结合我国国情对无菌检查法的检测范围及环境要求、培养体系、方法适用性、检查方法、偏差调
查与过程控制等方面都做了较大修订，进一步完善了无菌检查法，修订后的无菌检查法正逐步与国际通用标准一致。笔者对比了2010年版《中国药典》［4］，解读2015年版《中国药典》无菌检查法增修订概况，以推动新版药典的贯彻实施。
1.1 检测范围
2010年版《中国药典》无菌检查法的相关内容统一为新的标准方法，解决了长期以来各部之间相同方法要求不一致的问题，其检查范围增大，要求更明确、严格。除了规定药典要求无菌的药品、原料、辅料、生物制品及其他品种外，还将无菌医疗器具明确纳入检查范围。无菌医疗器具与无菌药品的使用密切相关，影响着无菌药品的安全使用。医疗器具在提高救治质量的同时，也可能成为环境病原菌的传播工具，造成医院感染的发生［4］，新的要求必将严格无菌医疗器具的监管，降低安全风险。
1.2 环境要求
新版药典无菌控制理念要求检测环境应与检测需求相适应，体现科学、合理的原则。目前，国际上对无菌检测环境无明确要求，但原则上无菌检查的试验环境应不低于无菌药品
的生产关键区域环境。相比2010年版《中国药典》规定的无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级单向流空气区域内进行的要求，2015年版《中国药典》中规定“无菌检查应在无菌条件下进行，实验环境必须达到无菌检查的要求”。无菌检查条件和无菌检查具体要求应是什么呢？2015年版《中国药典（四部）》通则9 203药品微生物实验室质量管理指导原则中给出了具体指导意见，无菌检查应在B级背景下的A级单向流洁净区域或隔离系统中进行。新版药典这一要求比之前的环境要求更严格，在无菌操作、预防措施、洁净度确认、隔离系统验证和环境监控等方面要求一致。新版药典在通则9203药品微生物实验室质量管理指导原则和9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则对试验环境和环境监控有更详细、具体的指导，增强了方法的可操作性、实用性、可靠性和规范性。
培养体系主要包括培养基、培养时间和培养温度等方面，微生物培养体系的差异导致了2010年版《中国药典》与国外药典无菌检查法的系统性差异，检查结果之间存在不确定性及不可比性。随着国际贸易的日益频繁，中外药典微生物培养体系的一致性需求成为一种趋势，新版药典无菌检查法微生物培养体系与国际通用标准一致。 1）无菌检查用培养基
2015年版《中国药典》无菌检查法规定，以硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基作为无菌检查的2种主要培养基，其中硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，胰酪大豆胨液体培养基主要用于需氧菌和真菌的培养，纠正了我国长期存在的将微生物划分为细菌和真菌的概念，以培养基的促生长能力和微生物的生长需要作为分类依据，将产品中可能污染的微生物在无菌检查中按需氧菌、厌氧菌和真菌进行培养。硫乙醇酸盐流体培养基自20世纪50年代起，国内外药典陆续将其收录，用于药品的无菌检查。但研究发现，其存在局限，该培养基并不能使所有的梭状芽孢杆菌生长，并提出应同时使用胰酪大豆胨液体培养基作为补充，这一建议随后被国外药典采纳。但该培养基之所以能沿用至今，是因为其具有不可替代的优势，硫乙醇酸盐流体培养基能在普通有氧环境下提供厌氧条件，使需氧菌和厌氧菌均能生长良好，并易于观察结果，这提供了一般实验室难以达到的厌氧培养条件［5-6］。试验证明，2010年版《中国药典》无菌检查法所用改良马丁培养基与国外药典胰酪大豆胨液体培养基虽然在促微生物生长能力（灵敏性）和适于微生物生长的种（广谱性）上无显著性差异，但胰酪大豆胨琼脂培养基的菌落形态较典型，且在培养霉菌方面略优于改良马丁培养基，且胰酪大豆胨液体培养基pH值为7.3±0.2，改良马丁培养基的pH值为6.4±0.2，更接近中性的pH环境，适宜于需氧菌和真菌的生长［7-9］。为与
可利霉素作用与用途国际标准接轨，新版药典无菌检查用培养基将胰酪大豆胨液体培养基取代了2010年版《中国药典》收载的改良马丁培养基。
新版药典无菌检查用培养基中对原来的“选择性培养基”名称进行了更正。因为选择性培养基是指能允许特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生长的增菌培养基。而2010年版《中国药典》及以前各版无菌检查法一贯收载的“选择性培养基”实际上是指为消除供试品的抑菌性而在原有培养基中加入中和剂、灭活剂后的培养基，不是严格意义上的选择性培养基，新版药典将其更名为准确的“中和或灭活用培养基”。
另外，新版药典无菌检查法中还规定培养基的pH值应在25℃测定。因温度对pH值有影响，培养基在配制过程中需要经过加热、溶解、灭菌等一系列处理，规定25℃的pH值也是对培养基质量提出了更严格的要求。
2）菌液制备用培养基
由于培养体系的变化，菌液制备所用的培养基、培养条件等要素也做了相应调整。其中用胰酪大豆胨液体培养基替代营养肉汤培养基，胰酪大豆胨琼脂培养基替代营养琼脂培养基，
沙氏葡萄糖液体培养基替代改良马丁培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基替代改良马丁琼脂培养基。新增沙氏葡萄糖琼脂和沙氏葡萄糖液体培养基用于白念珠菌和黑曲霉菌的菌液制备。
带电指示器
3）培养温度
温度是影响微生物生长的关键因素，与医药相关的微生物大多是嗜温的，其最适温度在环境温度和体温之间［10］。绝大多数微生物最适生长温度为25～37℃。2015年版《中国药典》硫乙醇酸盐流体培养基规定的培养温度与2010年版硫乙醇酸盐流体培养基规定的培养温度一致，为30～35℃，生物制品需增加1份20～25℃培养。但胰酪大豆胨液体培养基规定的培养温度为20～25℃，不同于原改良马丁培养基的培养温度23～28℃。金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌和大肠埃希菌最适生长温度为37℃，白念珠菌和黑曲霉最适生长温度为28℃，均为嗜温型微生物。微生物在最适温度生长最快，超过最适温度，热会破坏菌体的某些蛋白质而使细胞活力丧失，微生物生长的最适温度通常与规定的最高温度相对较近而与规定的最低温度相对较远。一般略低于最适温度对微生物生长影响不大，而高于最适温度会对微生物生长产生较大影响，因此结合培养基的促生长琴谱架
特性，尽量全面地覆盖微生物检出的种类和数量，无菌检查规定的培养温度20～25℃和30～35℃满足试验要求。
4）培养时间
在适宜培养条件下，细菌的体生长数量与培养时间的关系遵循生长曲线规律，延长培养时间有利于微生物的检出［11］。无菌产品中的微生物在生产工艺过程中会受到损伤而处于亚致死状态，受损微生物菌体在开始繁殖前需要有一段修复损伤的时间，一般标准方法中推荐的通常只是多数细菌恢复生长的最佳时间。如果减少培养时间会导致菌体生长数目大量减少，在定性试验方法中，导致假阴性结果。方法适用性下规定的培养时间为不得超过5 d。
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