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文件编号 | YZ-Q3(z)-ZL-10-202X | 版 次 | 第三版 |
制 定 立磨衬板 | | 审 核 | | 批 准 | |
制定日期 | | 审核日期 | | 批准日期 | |
mcu解密颁发部门 | | 颁发数量 | | 生效日期 | |
分发单位 | |
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目的：制定无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。
范围：本标准适用于本公司大容量注射剂无菌检验操作。
责任者：质管部、化验室主任、QC检验员
内容：
1、标准依据：《中国药典》202X年版二部附录XI H。
2、简述：无菌检查方法系用于检查药品是否无菌的一种方法。检查工程包含需气菌、厌气 菌及真菌检查。假设供试品符合该项检查方法的有关规定，仅说明了在该检验条件下未发觉微生物污染。 3、环境要求：该项检查应在环境洁净度万级〔C级〕背景下的局部百级〔A级〕的单向流地域内或隔离系统中进行。其全过程必须严格遵守无菌操作。预防微生物污染，但所采取的措施不得影响供试品中微生物的检出。操作前环境洁净度应经验证。一般检验需对试验环境进行监控。
5、方法验证：进行该项检查前应按照《无菌检查方法验证规程》确认该方法的适用性。
4、人员要求：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。
6、检验数量及检验量：
6.1、接种每种培养基所需的最少检验数量:2%或10个〔取较少者〕，供试品无菌检查假设采纳薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对比用；假设采纳直接过滤法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对比用。
6.2、每支供试品接入每种培养基的最少量:半量〔100ml≤V≤200ml〕，采纳薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种的供试品总接种量，只要供试品特性同意，应将全部容器内的全部内容物过滤。
7、细菌培养温度为30～35℃，真菌培养温度为23～28℃。
8、仪器用具：垂直层流超净工作台、生化培养箱、电热恒温水浴箱、显微镜、离心机、双碟、试管、三角瓶、刻度离心管、注射器〔针头〕、剪刀、镊子、注射器盒、75％酒精棉球、紫外光灯365nm、真空泵、一次性使用集菌培养器。
9、消毒剂配制：
9.1、75％乙醇溶液〔配制酒精棉球用〕。
9.2、0.2％新洁尔灭溶液〔配制消毒棉球用〕。
9.3、2％来苏尔溶液〔配制消毒棉球用〕。
10、试剂及培养基的配制：
10.1、0.1％蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温使溶化，滤清，调节PH值至7.1±0.2，分装，灭菌。 热顶结晶器10.2、pH7.0灭菌氯化钠－蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml微温溶化，滤清，分装，灭菌。
10.3、依据供试品特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后参加外表活性剂或中和剂。
10.4、硫乙醇酸盐流体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。分装的容器应适当，其装量与容器高度比例应符合培养结束后培养基氧化层〔粉红〕不超过培养基深度的1/2。供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则须经100℃水浴加热至粉红消逝〔不超过20分钟〕，迅速冷却只限加热一次，并应预防被污染。
10.5、改进马丁培养基：取商品枯燥培养基28.5g，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃高压灭菌15分钟〔假设枯燥培养基结块应勿使用〕。
10.6、选择性培养基：
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改进马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前参加适量的中和剂、灭活剂或外表活性剂，其用量同方法验证试验
10.7、营养肉汤培养基：按商品说明称取培养基，配制，加热，溶化，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。
10.8、营养琼脂培养基：取商品枯燥培养基3.4g，加蒸馏水1000ml，加热溶化分装，121℃高压灭菌15分钟。
安全带扣
10.9、改进马丁琼脂培养基：取商品枯燥培养基制备或按改进马丁培养基的处方及制法，参加14.0g琼脂，调节PH值使灭菌后PH值为6.4±0.2，分装，121℃高压灭菌15分钟。
10.10、制备好的培养基应保存在2～25℃，避光的环境中。培养基假设保存于非密闭容器中，一般在三周内使用。假设保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
11、试验前的打算工作
划线仪11.1、用具的洗刷
11.1.1、玻璃器皿：如试管、量筒、移液管、刻度吸管、离心管、三角瓶、双碟等用清洁液浸泡，用流水洗涤，再用蒸馏水洗涤4～5次，倒置，晾干。试管、移液管、三角瓶等使用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。
11.1.2、注射器用水冲洗后，用洗涤剂冲洗，然后用水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3次。
11.1.3、剪刀、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗干净，再用蒸馏水洗涤3次。
11.1.4、多用薄膜过滤器，玻璃管等用饮用水及蒸馏水洗净、晾干。
11.1.5、洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。
11.2、用具的包扎及灭菌
11.2.1、移液管、刻度吸管在管口上端内，松松塞入少许脱脂药物，然后每支管用白纸严密卷好，再用两层牛皮纸一起包扎。
11.2.2、洗涤洁净的注射器及适配针头各部件与剪刀、镊子一并入垫有纱布的铝盒内，一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。
11.2.3、试管、三角瓶等在管〔瓶〕口塞上纱布棉纱用牛皮纸包装严密。
11.2.6、将洁净服、等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。
11.2.7、将以上包扎好的用具在121℃蒸汽灭菌20分钟。或采取适宜的灭菌方法。〔适宜高温灭菌的器皿可采纳160℃干热灭菌〕
11.2.8、物品灭菌完毕，勿马上置冷处，以免急速冷却导致染菌，应置恒温培养箱中枯燥。
11.3、洁净室的清洁与灭菌
11.3.1、洁净室及超净台，每周用高锰酸钾加甲醛薰蒸灭菌。
11.3.2、在每次操作前，应作好清洁工作，并用0.2%新洁尔灭溶液或2%来苏尔或75％乙醇擦洗超净台工作台面及可能污染的死角，然后开启紫外线灯杀菌半小时，超净台空气过滤
器自净半小时。操作完毕后，用上述消毒液，再次处理工作台面，开紫外光灯杀菌30分钟以上。
12、操作
12.1、开启传递窗外侧门，将物品外表消毒后置传递窗内，关闭窗门。
12.2、操作人员按《进入洁净室更衣程序》洗手、更衣换工作鞋，换无菌衣、裤、口罩。进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭内侧门，经缓冲间带入洁净室内，物品放置于实验台上，关闭洁净室门，人员离开洁净室，继续用紫外灯照耀半小时，关灯，再将用具放入超净台内。
12.3、培养基适用性检查：无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基及改进马丁培养基等应符合的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。
12.3.1、无菌效果检查：每批培养基随机取不少于5支〔瓶〕培养14天，应无菌生长。
12.3.2、灵敏度检查：
12.3.2.1、菌种及菌液制备：
12.3.2.1.1、检查用菌种包含：
金黄葡萄球菌〔Staphylococcus aureus〕[CMCC(B)26 003]
铜绿假单胞菌〔Pstudomonas aeruginosa〕[CMCC(B)10 104]
枯草芽孢杆菌〔Bacillus subtilis〕[CMCC(B)63 501]
生孢梭菌〔Clostridium sporgenes〕[CMCC(B)64 941]
白念珠菌〔Candida albicaus〕[CMCC(F)98 001]
黑曲菌〔Aspergillus niger〕[CMCC(F)98 003]
12.3.2.1.2、菌液制备方法：铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法同金黄葡萄球菌菌悬液制备方法。
12.3.2.2、培养基接种：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于10
双层帐篷0CFU的金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种，作为空白对比，培养3天；每管装量为9ml的改进马丁培养基5支分别接种小于100CFU的白念珠菌、黑曲菌各2支，另一支不接种作为空白对比，培养5天。逐日观察结果。
12.3.2.3、结果推断：空白对比管应无菌生长，假设加菌的培养基管均生长良好，推断该培养基灵敏度符合规定。
12.4、配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周。临用前细菌和霉菌培养基分别经30～35℃和20～25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长时方可使用。
12.5、阳性对比试验：
12.5.1、应依据供试品特性选择阳性对比菌，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄葡萄球菌为对比菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对比菌；抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对比品；抗真菌的供试品以白念珠菌为对比品。
12.5.2、阳性对比试验的菌液制备同方法验证试验。
12.5.3、取各阳性对比菌悬液〔含菌量小于100CFU〕及供试品〔用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量〕，以无菌操作参加相应培养基中，培养48～72小时，检查应生长良好。〔阳性对比试验操作应与微生物限度检查操作隔离进行，预防交叉污染〕。
12.6、阴性对比试验：取供试品的相应溶剂或稀释剂冲洗液同法操作，培养14日应无菌生长。
12.7、供试品检查：
12.7.1、供试品外部消毒：包装瓶外壁用75％乙醇擦拭，待干。
12.7.2、供试品的制备：用灭菌镊子取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，注射器针头应迅速通过火焰数次，用注射器以无菌操作直接吸取供试液。或抽至已灭菌玻璃容器中，用稀释剂稀释为供试液，如为可溶于水的固体供试品，应取规定量，参加适宜的灭菌稀释液溶化做为供试液。
12.7.3、直接接种法：
取供试品，按上述操作进行外部消毒和制备后，用灭菌注射器以无菌操作自每管中吸取供试品，在近火焰旁以左手持培养基，右手半握拳，以小指和无名指拔开培养基管棉塞，管口通过火焰，移至火焰下侧，分别将各供试品1ml〔或规定量，除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%〕沿培养基管壁参加各培养基管内，每个供试品均分别接种硫乙醇酸盐流体培养基及改进马丁培养基各5管，另取硫乙醇酸盐流体培养基管一支，同法操作，操作结束后，接种对比菌液1ml〔小于100CFU〕作为供试品阳性对比。硫乙醇酸盐流体培养基，每管装量不少于15ml，改进马丁培养基不少于10ml。注入供试液时，切勿向液面直射，以免将空气中的氧带入培养基中，并在火焰旁将塞子塞严。接种后轻轻振动使均匀。
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