•论著•
LncRNA ZBED3-ASl/miR-339-5p/Notch1
仲艳I陆关珍1姬亚锋2王雍立$马志红彳史玲美$
1湖州市中心医院外科313000；2湖州市中心医院骨外科313000；3湖州市中心医院精准
医学临床研究中心313000
通信作者：陆关珍,Email:138********@，电话:138****5932
【摘要】目的探究LncRNA ZBED3-AS1调控miR-339-5p/Notch1在骨质疏松大鼠成骨细胞增殖分化
中的作用。方法构建假手术(Sham)组和模型(Model)组大鼠模型，对大鼠的骨密度进行检查观测大鼠建模 情况。分离大鼠成骨细胞，qRT-PCR检测细胞中ZBED3-AS1.miR-339-5p的表达。对Sham组和Model组大鼠
烟气道
成骨细胞进行分组后转染。CCK8、茜素红(AR-S)染、碱性磷酸酶(ALP)染检测各组细胞增殖分化能力。
FISH实验测定ZBED3-AS1在细胞中的分布。双荧光素酶报告证实ZBED3-AS1与miR-339-5p及miR-339-5p
和Notch1之间的关系。Western blot检测Notch通路相关因子的表达「结果检测股骨骨密度发现，Model组
大鼠骨密度明显低于Sham组大鼠(P=0.0057)o与Sham组大鼠比较,Model组大鼠成骨细胞中ZBED3-AS1
呈低表达，而miR-339-5p呈高表达(均P<0.05)o过表达ZBED3-AS1能促进成骨细胞的增殖分化；而敲减
ZBED3-AS1则能抑制成骨细胞增殖分化(均P<0.05)o ZBED3-ASl作为ceRNA调控miR-339-5p(均P<0.05)o
过表达miR-339-5p能抑制成骨细胞的增殖分化能力，而该作用可被ZBED3-AS1过表达部分挽救。Notch1被证
实为miR-339-5p的作用靶点，且干预ZBED3-ASl/miR-339-5p的表达能影响Notch1的蛋白表达,ZBED3-
ASl/miR-339-5p对成骨细胞的调控可能是通过Notch通路实现的。结论ZBED3-AS1能作为ceRNA调控
miR-339-5p，进而影响骨质疏松大鼠成骨细胞增殖分化。
【关键词】ZBED3-AS1；miR-339-5p；骨质疏松；成骨细胞；增殖；分化
基金项目：浙江省医药卫生学科平台项目(2018ZD045)；浙江省医药卫生科技计划项目(2020KY936)；湖
州市公益性研究项目(2018GYB42)
礼花发射器DOI：10.3760/l15807-20201209-00386
LncRNA ZBED3-AS l/miR-339-5p/Notch1axis regulates osteoblast proliferation and differentiation in os电缆转接箱
teoporotic rats Zhong Yan1,Lu Guanzhen',Ji Yafeng2,Wang Yongli2,Ma Zhihong^,Shi Lingmei2
捕虾笼'Surgical Department,Huzhou Centred Hospital,Huzhou313000,China;2Orthopeadic Surgery,Huzhou Centred
Hospital,Huzhou313000,China;3C linic a l Research Center of Precision Medicine,Huzhou Central Hospital,
Huzhou313000,China
Corresponding author:Lu Guanzhen,Email:138****************,Tel:138****5932
[Abstract]Objective To investigate the role of LncRNA ZBED3-AS1in osteoblast proliferation and dif
ferentiation in osteoporotic rats through regulating miR-339-5p/Notch 1.Methods The rat models of sham oper
ation(Sham)group and model(Model)group were established,and the bone mineral density(BMD)of rats was
examined.Rat osteoblasts were isolated and the expression of ZBED3-AS1and miR-339-5p was detected by qRT-
PCR.The osteoblasts of rats in Sham group and Model group were divided into different groups and transfected.
CCK8,alizarin red(AR-S)staining and alkaline phosphatase(ALP)staining were used to detect the proliferation
and differentiation ability of cells in each group.The distribution of ZBED3-AS1in cells was determined by FISH
assay.Double luciferase report confirmed the relationship between ZBED3-AS1and miR-339-5p as well as miR-
339-5p and Notch 1.Western blot was used to detect the expression of Notch pathway related factors.Results The
bone mineral density of femur in Model group was significantly lower than that in Sham group(P=0.0057).Compared with Sham group,the expression of ZBED3-AS1in osteoblasts of Model group was lower,while that of miR-339-5p was higher(all P<0.05).Overexpression of ZBED3-AS1could promote the proliferation and differentiation of osteoblasts,while knockdown of ZBED3-AS
1could inhibit the proliferation and differentiation of osteoblasts(all Pv0.05).ZBED3-AS1could regulate miR-339-5p as ceRNA(all P<0.05).Overexpression of miR-339-5p can inhibit the proliferation and differentiation of osteoblasts,which can be partially saved by overexpression of ZBED3-AS1.Notch1was confirmed as a target of miR-339-5p,at the same time,interfering with the expression of ZBED3-ASl/miR-339-5p can affect the expression of Notch-1protein,and the regulation of ZBED3-ASl/miR-339-5p on osteoblasts may be realized through Notch pathway.Conclusion ZBED3-AS1can be used as ceRNA to regulate miR-339-5p,and then affect the proliferation and differentiation of osteoblasts in osteoporotic rats.
[Key words]ZBED3-AS1;MiR-339-5p;Osteoporosis;Osteoblast;Proliferation;Differentiation Fund program：Zhejiang Medical and Health Discipline Platform Project(2018ZD045)；Zhejiang Medical and Health Science and Technology Program(2020KY936)；Huzhou Public W e lfare Research Project(2018GYB42) DOI：10.3760/l15807-20201209-00386
骨质疏松是常见于老年人的骨科疾病，以骨显微结构的破坏、骨量降低和骨基质蛋白的退变为特点。尽管医学在不断进步，但骨质疏松造成的骨折甚至瘫痪仍有待进一步寻方法。故探寻关于骨质疏松新的和预防方法是非常必要的。长链非编码RNA(LncRNA)和微小RNA(miRNA)近年来备受关注。LncRNA虽是一类长度在200个核昔酸以上的不编码蛋白质的RNA，但其参与许多重要的生理现象
和病理过程。最近研究发现.LncRNA与骨质疏松症和其他骨骼疾病密切相关，如Yin等“研究发现,LncRNAAK016739能抑制小鼠骨骼中成骨细胞的分化和骨形成，这表明LncRNA参与成骨细胞的分化和凋亡。据报道,ZBED3-AS1能诱导人滑液间充质干细胞形成软骨，可能改善骨关节炎的叫但其在骨质疏松中的作用仍有待进一步明确。Peng等网研究发现,ZBED3-AS1在间充质干细胞软骨分化过程中表达上调。而相关研究发现miR-339的下调可通过靶向DLX5促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，从而减轻骨质疏松铁本研究在之前的研究基础上，探究ZBED3-AS1靶向负调控miR-339-5P对骨质疏松大鼠成骨细胞增殖分化的影响。
1材料与方法
1.1试剂与仪器
实验所需动物购自浙江大学实验动物中心。胰蛋白酶(P4209)、CCK8试剂(C0039)、多聚甲醛(P0099)、茜素红S染液(ST1078)均为上海碧云天产品；II型胶原酶(9001-12-1)购自上海源叶生物科技有限公司；a-MEM诱导分化培养基(12561056)、逆转录试剂盒(4366597)、Lipofectamine3000试剂盒(L3000015)、PBS缓冲液(20012050)均为Thermo Fisher产品；DMEM培养基(11995)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(D0010)Jrizol试剂(15596026)、Triton X-100(P1080)、ALP试剂盒(BC2145)、RIPA 裂解液(R0010)、BCA试剂盒(PC0020)、ECL(PE0010)、DAPI染液(C0060)、Annexin-V-FITC/PI试剂
盒(CA1020)均购自北京索莱宝；一抗Notch1(ab52627)、二抗(ab6721)为Abeam公司产品。骨密度检测仪(InAlyzer)购自北京拜安吉科技有限公司；紫外分光光度计(UV-1800)购自上海美析仪器有限公司；酶标仪(HBS-1096C)购自南京德铁实验设备有限公司；流式细胞仪(Attune NxT)为Thermo Fisher产品；显微镜(DSX1000)、激光共聚焦显微镜(LEXT OLS4500)均购自0LYMPUS。
1.2动物模型构建
取40只3个月龄SD大鼠，雌性，体重(196.0±17.3)g。将所有大鼠维持在12h光/暗循环下，给予自由饮食和饮水。适应性饲养1周后，取30只大鼠构建模型(Model)组大鼠，1%钠对大鼠进行腹腔麻醉(0.1ml/lOOg)，于下腹部两侧各剪一个开口(约1cm)，开口处借助手术剪和银子切除大鼠双侧卵巢，随后对伤口进行缝合。其余10只大鼠作为假手术(Sham)组，打开腹腔切除少许脂肪组织后立即缝合。术后给予大鼠正常摄食和饮水，连续3d注射青霉素，饲养10周后对建模成功的大鼠进行后续实验，对建模未成功的大鼠进行安乐死。本实
验经本院动物伦理委员会审批同意（批号：16383）。
1.3大鼠骨密度检测
在实验后的第8周，将大鼠用1%钠进行麻醉，之后将大鼠置于骨密度检测仪上，检测大鼠股骨骨密度。
1.4细胞培养
取建模成功并存活的Sham组大鼠5只和Model组大鼠15只进行后续实验。将大鼠进行安乐死，除去远端骨膜和血液后,PBS冲洗股骨，直至其变白变亮。使用眼科剪将股骨剪成1mmxl mm 的切片,0.25%胰蛋白酶对股骨组织进行消化，之后用1%II型胶原酶进行消化60min，离心半径135cm，以14000r/min的转速离心后收集上清液中的白沉淀物。将沉淀物添加到含20%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，当细胞融合达到90%时，添加至培养皿中通过差速贴壁法对成骨细胞进行纯化。选择第4代成骨细胞，在a-MEM诱导分化培养基（含10%胎牛血清、1“mol/L地塞米松JOpmol/L维生素C、10mmoIVLp-甘油磷酸钠、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的）中进行培养。qRT-PCR检测成骨细胞中ZBED3-AS1、miR-339-5p的表达。
1.5 qRT-PCR
Trizol试剂用于成骨细胞中总RNA的提取，紫外分光光度计用于RNA的测定，逆转录试剂盒用于合成cDNA。根据qRT-PCR试剂盒说明书进行反应体系与反应条件的配置,2-AACt法计算各目的基因相对表达水平。miR-339-5p的内参为U6, ZBED3-AS1的内参为GAPDH（表1）。
1.6Western blot
收集Model组大鼠成骨细胞，加入1ml RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解结束后借助BCA试剂盒测定蛋白浓度。离心半径13.5cm，以12000r/min 的转速离心后分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭后加入一抗Notch1,4七摇床孵育过夜后洗膜并加入二抗，再次室温孵育后洗膜。ECL 显影液显影,ImageJ软件对蛋白进行灰度值分析。
1.7细胞分组和转染
对大鼠成骨细胞进行分组，分组如下：Normal组（Sham组大鼠成骨细胞）、NC组（Model组大鼠成骨细胞+转染阴性对照载体）、ZBED3-AS1组（Model 组大鼠成骨细胞+转染ZBED3-AS1过表达载体）、si-ZBED3-ASl组（Model组大鼠成骨细胞+转染ZBED3-AS1siRNA载体）、miR-339-5p mimic组（Model组大鼠成骨细胞+转染miR-339-5p过表达载体）、ZBED3-ASl+miR-339-5p mimic组（Model组大鼠成骨细胞+共转染ZBED3-AS1和miR-339-5p 过表达载体）。细胞转染步骤根据Lipofectamine 3000试剂盒说明书进行。
1.8CCK8
取对数生长期的成骨细胞，细胞按照1X10W孔接种至96孔板中，在细胞培养24、48、72及96h后添加10口CCK8试剂。继续孵育2h后，借助酶标仪检测各组细胞450nm处的0D值。
1.9茜素红（AR-S）染
弃成骨细胞原培养基，将细胞用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛进行固定10min。之后，经0.1%茜素红S染液进行染30min，蒸懈水进行冲洗3次。显微镜下观察染细胞并拍照记录。
1.10碱性磷酸酶（ALP）活性测定
将成骨细胞按照每孔lxlO4/个数目接种到96孔板中，在每孔中加入200|il l%Triton X-100，使用ALP试剂盒来测定ALP活性。
1.11FISH实验
制备细胞爬片后用4%多聚甲醛进行固定，在
表1引物序列
基因序列（5'-3'）
ZBED3-AS1F:TACAACTTTGCATTAACCTTCC
R：TGCCCTGTCCTCATGTTCG
miR-339-5p F:TCCCTGTCCTCCAGGAGCTC
R:GAACATGTCTGCGTATCTC
U6F:GCCCCCGCCTCCGCCGCCGCC
R:ATATGGAACGCTTCACGAATT GAPDH F:GGAGCGAGATCCCTCC A A A AT
R:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
爬片中加入含0.5%Triton X-100的PBS，预杂交液在37七下封闭,ZBED3-AS1探针于温度37T下过夜。之后滴加DAPI染液进行避光染20min，借助封片剂将细胞爬片固定在载玻片上，激光共聚焦显微镜下进行观察。
1.12双荧光素酶报告实验
靶向关系预测网站LncRNA SNP预测ZBED3-ASl/Notch1与miR-339-5p是否存在结合位点。之后设计与miR-339-5p存在潜在结合位点的ZBED3-ASl/Notch1野生型序列，对二者之间的潜在结合位点进行突变设计突变型序列。将野生型与突变型序列分别克隆到pmirGLO上游，miR-339-5p mimic和NC分别与ZBED3-AS1/Notch1野生型或突变型序列两两共转染至HEK-293T细胞中，转染步骤参照Lipofectamine3000试剂盒说明书。双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞中的相对荧光素酶活性。
1.13统计学分析
通过SPSS21.0进行统计学分析，测量数据表示为平均值士标准差G±5），两组间比较采用/检验，多组间比较采用单因素方差进行分析°P<0.05为差异有统计学意义。中央控制
2结果
2.1模型组大鼠骨密度明显低于假手术组
通过骨密度检测仪检测大鼠股骨骨密度发现，与假手术组大鼠比较，模型组大鼠股骨骨密度较低（P=0.0057）（图l）o
2.2模型组大鼠中ZBED3-AS1低表达，miR-339-5p高表达
qRT-PCR检测假手术组和模型组大鼠成骨细胞中ZBED3-AS1和miR-339-5p的表达显示（图2），对比假手术组，模型组大鼠成骨细胞中ZBED3-AS1表达下调，miR-339-5p表达上调（均P<0.05）o 2.3ZBED3-AS1促进成骨细胞增殖分化
干预成骨细胞中ZBED3-AS1的表达发现，与Normal组相比，其余各组成骨细胞的增殖分化能力降低（均P<0.05）o相较于NC组,ZBEI）3-AS1组中细胞的增殖分化能力增强而si-ZBED3-ASl组的细胞增殖分化能力减弱（均P<0.05）（图3）o
2.4ZBED3-AS1作为海绵分子靶向吸附miR-339-5p
FISH实验检测ZBED3-AS1在细胞中的表达发现，其主要存在于细胞质中，作为ceRNA发挥功能（图4A）。靶向关系预测网站LncRNA SNP预测ZBED3-AS1与miR-339-5p存在结合位点（图4B）；双荧光素酶报告检测进一步证实了miR-339-5p能靶向抑制ZBED3-AS1野生型序列的荧光素酶活性，未对ZBED3-AS1突变型序列的荧光素酶活性产生太大影响（图4C）。
2.5过表达miR-339-5p对成骨细胞的作用能被上调ZBED3-AS1部分挽救
调控成骨细胞中miR-339-5p的表达发现，对比Normal组，其余各组细胞增殖分化能力下降（均P<0.05）o与NC组相比,miR-339-5p mimic组细胞的增殖分化能力削弱（均P<0.05）o相对于miR-339-5p mimic组，miR-339-5p mimic+ZBED3-AS1组细胞增殖分化能力有所增强（均P<0.05），提示miR-339-5p对成骨细胞的作用能够被ZBED3-AS1部分挽救（图5）。
2.6ZBED3-ASl/miR-339-5p对骨质疏松成骨细胞的调控作用可能通过Notch通路实现
Reactome pathway（/）网站显示Notch通路为骨质疏松发病的重要通路之一且以往已有充分证据支持。RNA22靶向关系在线预测网站进一步发现miR-339-5p和Notch通路
注:•与假手术组相比，P<0.05
图2ZBED3-AS1与miR-339-5p在各组大鼠中
的表达
〜NC
-ZBED3-ASI
一si-ZBEI)3-ASI Nonnal
-B ZBED3-ASI
M：
si-ZHED3-ASI
注：与Normal组相比/为P<0.05；与NC组相比/为P<0.05
图3ZBED3-AS1促进成骨细胞增殖分化.A：CCK8检测细胞增殖结果；B：ALP活性测定结果；C：AR-S染结果
Merge
DAPI
ZI)F；I)3-ASI
.5
miR-339-5p:3'GCACUCGAGGACCUCCUGUCCCU5'
II llllllll
ZBED3-AS1：5'GGTGCCGAACATGAGGACAGGGC3*
B 兰史腿
•孤主舉W HI
注:"与共转染NC和ZBED3-AS1-WT组相比,P<0.05
图4ZBED3-AS1靶向调控miR-339-5p。A：FISH实验检测结果;B：靶向关系预测结果;C：双荧光素酶报告结果
安全门卡相关因子Notchl之间存在特异性结合位点（图6A），双荧光素酶报告实验进一步验证了二者之间的靶向关系（图6B）。之后通过Western blot对干预ZBED3-ASl/miR-339-5p表达后，Notch通路相关因子的蛋白表达进行检测，结果发现过表达miR-339-5P能抑制Notch通路相关因子的蛋白表达而ZBED3-AS1则相反（图6C-F），提示ZBED3-AS1/ miR-339-5p对成骨细胞的作用可能是通过调节Notch通路实现的。
3讨论
骨骼是一种动态组织，不断被破骨细胞吸收并被成骨细胞重建，一旦吸收和重建之间不平衡，极易发生骨质疏松。故造成骨质疏松的一个重要因素是成骨细胞的增殖分化受到抑制，无法形成足量的非胶原性蛋白和骨胶原蛋白，骨量和骨质量均下降。
越来越多的研究表明Lnc RNA和miRNA在成骨细胞增殖分化及凋亡中扮演着重要的角。Yu 等网研究发现LncRNA TUGl轴调控miR-204-5p/ Runx2在主动脉瓣钙化中促进成骨细胞的增殖分化；Bu等问研究证实LncRNA TSIX通过下调miR-30a-5p促进颗粒诱导的骨溶解过程中的成骨细胞凋亡。通过构建骨质疏松大鼠模型并成功分离大鼠成骨细胞后检测细胞中ZBED3-AS1和miR-339-5p 的表达发现,ZBED3-ASl在骨质疏松大鼠成骨细胞中的表达下降，miR-339-5p在细胞中的表达
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