天津医药2023年1月第51卷第1期
lnc-NONHSAT074080调控靶基因ARL6IP4参与RA-UIP 发病的机制研究
刘媛1，2
，鲁芙爱1，王乐2，杨有国2，李小芬2，肖运平3△
摘要：目的探讨lnc-NONHSAT074080在类风湿关节炎（RA ）相关普通型间质性肺炎（UIP ）发病中的作用及调
控机制。方法按是否合并UIP 分为RA 肺纤维化组4例及RA 对照组4例。留全血，Affymetrix 基因芯片筛选RA 肺纤维化发病相关的长链非编码RNA （lncRNA ）进行生物信息学分析，并对表达上调明显的10个lncRNA 进行实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR ）验证。选择经qPCR 验证，在RA 肺纤维化组表达明显升高，且生物信息学分析与肺纤维化进程相关的lncRNA 作为目标lncRNA 。构建目标lncRNA 的shRNA ，荧光素酶基因报告验证目标lncRNA 与靶基因的关系。以目标lncRNA shRNA 转染转化生长因子（TGF ）-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系，CCK-8法检测细胞的增殖能力，细胞免疫荧光检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）的表达，qPCR 检测细胞中目标lncRNA 及靶基因的表达，酶联免疫吸附试验检测 细胞中Ⅰ型胶原及纤连蛋白表达。结果与RA 对照组相比，RA 肺纤维化组患者全血中存在192个表达明显上调的lncRNA ，qPCR 结果显示lnc-NONHSAT074080在RA 肺纤维化组患者全血中的表达升高（P ＜0.05）；生物信息学分析及荧光素酶基因报告表明lnc-NONHSAT074080与纤维化进程相关，作用的靶基因是ARL6IP4，可能通过分裂原激活蛋白激酶（MAPK ）、信号转导子和激活因子（STAT ）等纤维化相关信号通路发挥作用；与空白对照组相比，TGF-β1组细胞增殖水平、α-SMA 、lnc-NONHSAT074080、ARL6IP4、Ⅰ型胶原和纤连蛋白表达水平明显升高（P ＜0.05）；与TGF-β1组比较，TGF-β1+NONHSAT074080shRNA 组上述变化趋势相反（P ＜0.05）。结论lnc-NONHSAT074080与RA-UIP 的发病及纤维化进程相关，可能通过调控靶基因ARL6IP4参与纤维化进程。
关键词：关节炎，类风湿；肺疾病，间质性；RNA ，长链非编码；胶原Ⅰ型；纤连蛋白类；lnc-NONHSAT074080中图分类号：R593.2文献标志码：A DOI ：10.11958/20220644
Study on the mechanism of lnc-NONHSAT074080regulating target gene ARL6IP4
involved in the pathogenesis of RA-UIP
LIU Yuan 1,2,LU Fuai 1,WANG Le 2,YANG Youguo 2,LI Xiaofen 2,XIAO Yunping 3△
1Department of Rheumatology,First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Baotou 014010,China;2Department of
Rheumatology,3Department of Radiology,Liuzhou People's Hospital,Guangxi Medical University
△
Corresponding Author E-mail:Abstract:Objective To investigate the role and regulatory mechanism of lnc-NONHSAT074080on the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA)-related common interstitial pneumonia (UIP).Methods According to whether combined with UIP,patients were divided into the RA pulmonary fibrosis group (n =4)and the RA control group (n =4).The long non coding RNA (lncRNA)related RA pulmonary fibrosis was analyzed by Affymetrix gene chip.The bioinformatics analysis was carried out,and lncRNAs with significantly up-regulated expression were verified by real-time auantitative polymerase chain reaction (qPCR).The lncRNA,which was verified by qPCR and showed significantly increased expression in RA pulmonary fibrosis,bioinformatics analysis showed the relationship with the process of pulmonary fibrosis,was selected as the target lncRNA.Then target lncRNA shRNA was constructed ，as well as the relationship between the target lncRNA and the target gene was verified by luciferase gene report.Moreover,TGF-β1-induced
human embryonic lung fibroblasts were transfected with target lncRNA shRNA.CCK8was used to detect cell proliferation,and immunofluorescence was used to detect the expression of αsmooth muscle actin (α-SMA).qPCR was used to detect the expression of target lncRNA and target genes,and enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression of Ӏcollagen and fibronectin in cells.Results There were 192significant upregulated lncRNA in the whole blood of RA pulmonary fibrosis group compared to the RA control group.qPCR showed that the expression of lnc-NONHSAT074080in RA pulmonary fibrosis group was significantly increased (P ＜0.05).Bioinformatics analysis and luciferase gene report showed that lnc-NONHSAT074080was related to fibrosis progression.The possible target gene including ARL6IP4may play a role through
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81960304）；柳州市科技计划项目（2020NBAA0804）
rbd-446作者单位：1包头医学院第一附属医院风湿免疫科（邮编014010）；2广西医科大学附属柳州市人民医院风湿免疫科，3放射科作者简介：刘媛（1982），女，副主任医师，主要从事风湿病发病机制方面研究。E-mail ：△
通信作者E-mail ：细胞与分子生物学
1
Tianjin Med J,January2023,Vol.51No.1
类风湿关节炎（RA）是一种以关节侵蚀破坏为主要特征的系统性自身免疫病，间质性肺疾病（ILD）是RA最常见的系统受累表现，也是导致RA患者死亡的主要原因［1］。普通型间质性肺炎（UIP）是RA-ILD常见的病理类型之一，以肺组织结构明显破坏和广泛纤维化为特征，与特发性肺纤维化的表现和预后相似，是RA-ILD预后较差的病理类型［2］。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，参与细胞分化、免疫调控、组织纤维化等重要的生物学功能，从多层面调控基因的表达，参与疾病发生发展，为近年来的研究热点。lncRNA的表达或功能障碍与遗传性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤密切相关［3-4］。lncRNA在多种纤维化组织中存在特异性的表达谱，被认为是纤维化的功能调节器，某些差异表达的lncRNA在肺纤维化的发生发展中发挥重要的调控功能［5］。然而，lncRNA在RA-UIP 发病中的具体作用及机制尚不清楚。本研究通过基因芯片筛选RA-UIP患者全血中表达上调的lncRNA，并采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测验证，同时从细胞水平验证目标lncRNA与肺纤维化的关系，在肺纤维化进程中的作用及调控的靶基因，探讨其在RA-UIP发病中的作用。
1对象及方法
1.1研究对象及分组选取2019年1—12月就诊于包头医学院第一附属医院的RA患者8例，按是否合并UI
P分为RA 肺纤维化组（4例），平均（59.25±1.26）岁；RA对照组（4例），平均（59.75±0.96）岁，2组年龄差异无统计学意义（t=0.298，P＞0.05），男女比例均为1∶3。纳入标准：（1）RA诊断满足2010年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟提出的RA分类标准。（2）合并UIP的患者满足2011美国胸科学会和欧洲呼吸学会提出的UIP分级诊断标准。排除标准：（1）有慢性疾病史。（2）合并其他结缔组织病。（3）非初次的RA。（4）合并除肺脏外的其他重要脏器系统损害。（5）行肺组织活检。本研究通过包头医学院伦理委员会审批并获得研究对象知情同意。
1.2材料RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；体外转录试剂盒购自美国Ambion公司；基因片段和标记试剂盒购自美国Affymetrix公司；SYBR Green荧光定量反转录试剂盒购自日本TAKARA公司；人肾上皮细胞系（293T）购自美国ATCC；人胚肺成纤维细胞购自中国科学院细胞库；DMEM培养基、胎牛血清、细胞冻存液及胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）购自美国Gibico；Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；转化生长因子（TGF）-β1重组蛋白购自美国Selleck公司；CCK-8试剂盒购自广州赛国生物科技有限公司；小鼠抗人α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗及羊抗鼠二抗购自美国Sigma-Aldrich公司；Affymetrix Clariom D基因芯片检测和引物设计委托南宁友田生物科技有限公司；lnc-NONHSAT074080短发卡RNA（shRNA）慢病毒载体构建由南京临度医疗科技有限公司构建；Ⅰ型胶原和纤连蛋白酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自厦门仑昌硕生物科技有限公司。Affymetrix杂交炉、GeneChip Scanner3000激光扫描仪和Affymetrix Fluidics Station450洗脱站均购自美国Affymet rix 公司；qPCR仪7500购自美国ABI公司；二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司；低温冷冻离心机购自德国HERMLE公司；酶标仪购自美国Molecular Devices公司；流式细胞仪购自美国BD公司。
1.3方法
1.3.1Affymetrix Clariom D基因芯片检测差异基因及生物信息学分析在确诊后未开始前，收集研究对象的全血样本3mL。提取全血总RNA并质检（保证RNA的起始质量浓度达到17mg/L，且RNA无明显降解和样本污染）。取质检合格的250ng总RNA用配套的体外转录试剂盒制备生物素标记的cDNA样品，将5.5µg cDNA样品于杂交炉中45℃条件下滚动杂交16h，Affymetrix Fluidics Station450将芯片进行洗脱、染后采用GeneChip Scanner3000扫描仪进行扫描，然后由Affymetrix GeneChip Command Console（AGCC）读取其数据，采用Gene Spring软件（安捷伦科技有限公司）进行生物信息学分析。
1.3.2qPCR检测上调lncRNA的表达选取2组基因芯片比较分析中基因表达差异倍数＞2的10个lncRNA，设计特异性引物，引物序列见表1。采用Trizol-RNA提取试剂盒提取患者全血中的总RNA，反转录为cDNA，以此为模板采用SYBR Green相对定量法进行qPCR验证，反应条件：95℃预变性2 min；95℃10s，55℃15s，72℃15s，共40个循环。选择qPCR验证后，RA肺纤维化组lncRNA的表达高于RA对照组，且在生物信息学分析中发现的与肺纤维化进程相关的lncRNA进行后续实验。
1.3.3荧光素酶标记实验将lnc-NONHSAT074080结合序列克隆到表达载体pcDNA3.1上，构建表达质粒；靶基因ARL6IP4的mRNA3′-UTR的片段插入到报告载体psiCHECK2，构建报告质粒。将空载体、lnc-
fibrosis related pathway such as mitogen-activated protein kinase(MAPK)and signal transducer and activator of transcription(STAT)signal pathways.Compared with the blank control group,the proliferation level,α-SMA,lnc-NONHSAT074080,ARL6IP4,type I collagen and fibronectin expression levels were significantly increased in the TGF-β1 group(P＜0.05).Compared with the TGF-β1group,the TGF-β1+NONHSAT074080shRNA group showed the opposite trend(P＜0.05).Conclusion lnc-NONHSAT074080is associated with the pathogenesis and fibrosis process of RA-UIP, and may participate in fibrosis in the fibrosis process by regulating the target gene ARL6IP4.
Key words:arthritis,rheumatoid;lung diseases,interstitial;RNA,long noncoding;collagen type I;fibronectins;lnc-NONHSAT074080
2
天津医药2023年1月第51卷第1期
NONHSAT074080表达质粒和ARL6IP4报告质粒转染人肾上皮细胞系细胞，分为空载体对照组、pCDNA3.1+ARL6IP4-psiCHECK2负对照组，pCDNA3.1-NONHSAT074080+ psiCHECK2组及pCDNA3.1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2组。各组细胞培养48h后，收集细胞加入细胞裂解液，按照荧光素酶检测试剂盒的操作说明分别加入各检测试剂，使用酶标仪读取各组细胞海肾和萤火虫荧光强度，以海肾荧光值作为内参，计算各组细胞荧光素酶活性的比值。
1.3.4人胚肺成纤维细胞的培养及处理人胚肺成纤维细胞系复苏培养后以3×106个/mL的密度接种于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后换液，除去未贴壁的细胞及细胞碎片，每2~3d换液1次。待细胞汇合成片后，传代及鉴定。1.3.5lnc-NONHSAT074080shRNA质粒载体的构建及细胞转染针对NONHSAT074080基因的cDNA序列设计shRNA，并构建NONHSAT074080shRNA慢病毒载体，转染人胚肺成纤维细胞，荧光显微镜鉴定转染效率，qPCR检测NONHSAT074080的基因表达。lnc-NONHSAT074080 shRNA转染效率和沉默效果验证后，将人胚肺成纤维细胞分为空白对照组（未处理）、TGF-β1组（细胞饥饿24h，给予5µg/L TGF-β1）、TGF-β1+NONHSAT074080shRNA组（5µg/L TGF-β1处理后给予lnc-NONHSAT074080shRNA转染48h），收集细胞及上清液。
1.3.6CCK-8法检测细胞增殖能力将人胚肺成纤维细胞以3×103个/孔的密度接种在96孔板中，每孔100µL，每组3个复孔，置于常规培养箱孵育，细胞融合度达80%时，根据1.3.5分组进行干预，在干预0、24、48、72及96h后，每孔加入10µL CCK-8试剂后继续孵育细胞2h，在450nm波长处测定其光
密度值，检测不同时间点人胚肺成纤维细胞增殖水平。
简易过滤器
1.3.7细胞免疫荧光检测α-SMA的表达将人胚肺成纤维细胞以1×104个/孔密度转移至6孔板制成细胞爬片，当细胞生长密度达到约50%时，除去培养基，磷酸盐缓冲液清洗后加入1mL预冷的95%乙醇置于-20℃固定；吸除乙醇，每孔加入1mL5%胎牛血清蛋室温封闭20min；加α-SMA一抗室温孵育60min；PBS清洗后加入含标记的羊抗小鼠二抗，5%BSA-PBS室温避光孵育2h；PBS清洗3次；避光环境下加入适量6-联脒-2′-苯基吲哚（DAPI）染1min；甘油封片，共聚焦荧光显微镜下观察α-SMA的表达。
1.3.8qPCR检测lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4的mRNA表达根据1.3.5分组对人胚肺成纤维细胞进行干预，收集细胞，Trizol-RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA，参照1.3.2中的qPCR检测方法检测lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4的mRNA表达水平。lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4的引物序列见表1。
1.3.9ELISA测定Ⅰ型胶原及纤连蛋白的表达将各组人胚肺成纤维细胞以1×104个/孔的密度接种于6孔板中，细胞
基因名称
lnc-TMEM140-1：1 lnc-NONHSAT071210 lnc-RP11-326I11.5 lnc-RP11-158I9.5.1-2：1 lnc-DPYD-IT1
lnc-NONHSAT074080 lnc-NONHSAT047350 lnc-NONHSAT101272 lnc-NONHSAT115197 lnc-NONHSAT082317 ARL6IP4 GAPDH
引物序列（5＇→3＇）
上游：GCCAGCCTGACTGACGCAATC
下游：CCGGTGTTCAGCCAGTGTTAATCC
上游：ATGGTGCTGGGAAAACTGGC
下游：TGCCCATGCCTATGTCCTGA
上游：CAGGCGGTGGATAGTCTTGATGC
下游：TGAATCTGCGTGCGTGGTGAAG
上游AAGAGGTGGACAGGTGGTATGAGG
下游：GCTTCTGGCAGTTCCGTGGTC
上游：GGTCCTTACTGCCACTCCCA
下游：ATCTCAGGGAACAGGGAGGC
上游TCAACAAGGGAGAAGAAGGTTTGA
下游：TGCTGTTGTTAGTTGGAGGCT
上游：GATCGGTGACCTTACCCCCA
下游：CAAAGCACATCTTGCACCGC
上游：TAACGGTGGCTCTCTCAGCA
下游：CTTGTAAGGCAGGCCTGGTG
上游：TGGAAACTGAACAACCTGCTCC
上游：TGGCTTCTGTTGCCATTGCT
dmx512协议
上游：TGGGCGGTGTCTGCTGTG
下游：ACTCACTGCGCACACAGACT
上游：TCTAGTGTGTAGTCTGTGTGC
下游：ACCACACAGTACATACCACAT
上游：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG
下游：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA
产物大小（bp）
120
173
94投影墙
146
657
86
95
198
2270
657
217
131 Tab.1Primer sequence of lncRNA
表1长链非编码RNA的引物序列
3
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贴壁后，继续培养24h ，1000r/min 离心10min ，取各组细胞上清液。在Ⅰ型胶原及纤连蛋白抗体预包被的酶标板反应孔中依次加入标准品、对照品和样品（50µL/孔），室温孵育2h ；加100µL 酶结合物工作液，室温避光孵育20min ；加入50µL 终止液终止反应。使用酶标仪在450nm 测定光密度值，计算Ⅰ型胶原及纤连蛋白的蛋白表达水平。每组重复3次。
1.4统计学方法采用SPSS 17.0软件进行数据分析，符合
正态分布的计量资料以均数±标准差（x ±s ）表示，2组间的比
较采用t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较时若方差齐采用LSD-t 法，方差不齐采用Tamhane 法；不同时间点的多组比较采用重复测量的方差分析。P ＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1RA-UIP 疾病相关lncRNA 的筛选和生物信息学分析基因芯片检测发现，与RA 对照组相比，RA 肺纤维化组患者存在192个上调表达的lncRNA （差异倍数＞1.1，P ＜0.05），见图1。
2.2qPCR 验证差异lncRNA 与RA 对照组相比，RA 肺纤维化组lncRNA NONHSAT074080、NONH⁃SA
T071210、NONHSAT047350、NONHSAT101272、DPYD-IT1及NONHSAT082317的mRNA 表达明显
升高（P ＜0.05），而RP11-158I9.5.1-2：1、RP11-326I11.5、TMEM140-1：1及NONHSAT115197在2组间差异无统计学意义，见表2。
2.3lnc-NONHSAT074080的生物信息学分析对上述结果中qPCR 验证的6个在RA 肺纤维化组高表达的lncRNA 进行生物信息学分析，结果发现与纤维化生物学功能相关的为lnc-NONHSAT074080，见图2；lnc-NONHSAT074080可能作用的靶基因包括ARL6IP4，且为上调靶基因，见图3；lnc-NONHSAT074080可能通过分裂原激活蛋白激酶（MAPK ）、信号转导子和激活因子（STAT ）等信号通路发挥作用，见图4。
2.4lnc-NONHSAT074080对靶基因ARL6IP4的调
控作用荧光素酶基因报告显示，空载体对照组、pCDNA3.1+ARL6IP4-psiCHECK2负对照组、pCDNA 3.1-NONHSAT074080+psiCHECK2组和pCDNA 3.1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2组ARL6IP4的荧光表达量分别为1.491±0.066、0.931±0.027、1.493±0.009和1.149±0.039，差异有统计学意义（n =3，F =172.570，P ＜0.05）。与空载体对照组相比，pCDNA3.1+ARL6IP4-psiCHECK2负对照组
＊
P ＜0.05，＊＊
P ＜0.01。
Tab.2
Comparison of upregelated lncRNA expressions in whole blood between the two groups of patients
表22组患者全血中上调表达的lncRNA 表达水平比较
（n =4，x ±s ）组别RA 对照组RA 肺纤维化组t
NONHSAT0740801.000±0.0026.108±2.1802.343＊
NONHSAT0712101.000±0.3172.447±0.2126.097＊＊RP11-158I9.5.1-2:1
1.000±0.0540.637±0.162
2.239
NONHSAT0473501.000±0.2533.868±0.7283.911＊＊
NONHSAT1012721.000±0.0022.885±0.5173.646＊＊
组别RA 对照组RA 肺纤维化组
t
RP11-326I11.51.000±0.0033.396±1.4871.611DPYD-IT1
1.000±0.006
2.418±0.447
3.172＊
TMEM140-1：11.000±0.0653.453±1.3001.886NONHSAT1151971.000±0.0121.341±0.2071.649NONHSAT0823171.000±0.0042.099±0.2374.643＊＊210
-1-2Fig.1
Upregulated lncRNA in whole blood in the two groups 图1
2组患者全血中表达上调的lncRNA
RA 肺纤维化组RA 对照组
纤维化进程
低密度脂蛋白颗粒受体分解代谢过程的正调控
血管生成多巴胺分泌的正调节纤毛运动
过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR ）信号通路
钙离子依赖性胞吐作用的负调控饮食行为的调节视紫红质介导的信号通路调控cGMP 生物合成过程的正调控
1
2
3
4
5
6
-Lg P
Fig.2
Bioinformatics analysis showing biological function of
lnc-NONHSAT074080
图2生物信息学分析lnc-NONHSAT074080的生物学功能
4
天津医药2023年1月第51卷第1期
Fig.4Boinformatics analysis showing signal pathways of
lnc-NONHSAT074080
图4
生物信息学分析lnc-NONHSAT074080作用相关的
信号通路
上调基因标记为红，下调基因标记为蓝。
Fig.3bioinformatics analysis showing possible target gene of
lnc-NONHSAT074080
图3
生物信息学分析lnc-NONHSAT074080可能调控的靶基因
ARL6IP4的荧光表达量明显降低（P ＜0.05）；pCDNA3.1-NONHSAT074080+psiCHECK2组ARL6IP4的荧光表达量较pCDNA3.1+ARL6IP4-psiCHECK2负对照组升高（P ＜0.05）。2.5lnc-NONHSAT074080对人胚肺成纤维细胞增殖的影响与空白对照组相比，TGF-β1组细胞增殖水平在干预24、48、72和96h 后升高（P ＜0.05）；与TGF-β1组相比，TGF-β1+NONHSAT074080shRNA 组细胞增殖能力在干预48、72及96h 后明显下降（P ＜0.05），见表3。2.6lnc-NONHSAT074080对α-SMA 表达的影响免疫荧光结果显示，与空白对照组相比，TGF-β1组α-SMA 的荧光表达升高；但TGF-β1+NONHSAT074080shRNA 组与TGF-β1组相比，α-SMA 的荧光表达明显减少，见图5。2.7lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4与纤维化的关系与空白对照组相比，TGF-β1组的人胚肺成纤维细胞中lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4mRNA 表达水平明显升高（P ＜0.05）；TGF-β1+NONHSAT07408
0shRNA 组lnc-NONHSAT074080和ARL6IP4mRNA 表达水平较TGF-β1组明显降低（P ＜0.05），见表4。2.8lnc-NONHSAT074080对纤维化进程相关因子表达的影响ELISA 结果显示，TGF-β1组Ⅰ型胶原
组别空白对照组TGF-β1组
TGF-β1+NONHSAT074080shRNA 组
F 0h
0.063±0.0090.061±0.0060.059±0.005
0.52424h
0.496±0.0340.689±0.010a
0.804±0.018
51.234＊＊48h
泥浆泵压力传感器0.844±0.040
0.975±0.012a
0.739±0.113b
63.895＊＊72h
1.088±0.019
1.336±0.016a
1.065±0.025b
39.174＊＊
96h
1.183±0.091
1.528±0.055a
1.098±0.025b 28.110＊＊
Tab.3The proliferation of different interventions in human embryonic lung fibroblasts at different time points
qsc6270
表3不同处理组人胚肺成纤维细胞各时间点的增殖水平
（n =3，x ±s ）＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；a 与空白对照组比较，b 与TGF-β1组比较，P ＜0.05；F 时间=915.877＊，F 组间=60.625＊，F 交互=27.388＊
。
空白对照组TGF-β1组TGF-β1+NONHSAT074080shRNA 组
Fig.5
The expression of α-SMA in human embryonic lung fibroblasts treated with different interventions (×
400,rhodamine dying ）
图5
不同处理组人胚肺成纤维细胞中α-SMA 的表达（×400，四乙基罗丹明染）
5
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