·研究报告·玉蝉卫肺丸对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜嗜酸粒 杨斌1孙洮玉2刘真1崔晔1徐春英1△
（1.中国中医科学院西苑医院，北京100091；2.北京中医药大学东直门医院，北京100700）
防摔玻璃杯中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1004-745X（2020）12-2081-04
数字收音机
doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2020.12.004
【摘要】目的观察玉蝉卫肺丸对变应性鼻炎（AR）大鼠鼻黏膜组织内嗜酸粒细胞、IgE表达水平及肥大细胞 数量的影响。方法雄性SD大鼠32只，随机选取其中8只为对照组，剩余大鼠为造模组，分别为AR鼻炎模型
组、玉蝉卫肺丸组、氯雷他定组，每组8只。造模组大鼠给予卵蛋白联合Al（OH）3腹腔注射及5%OVA生理盐
水滴鼻激发鼻黏膜法建立变应性鼻炎模型，造模成功后各组给予相应的药物处理。Wright染检测鼻腔分泌
物嗜酸性粒细胞个数，ELISA检测血清中IgE水平，HE染镜下观察鼻黏膜组织病理形态学变化，免疫组化检
测鼻黏膜组织内肥大细胞表达水平。结果1）嗜酸粒细胞数量及IgE水平：与对照组相比，AR模型组嗜酸粒细
胞数量增多，IgE表达水平增加（P<0.05）；与AR模型组相比，玉蝉卫肺丸组与氯雷他定组嗜酸粒细胞数量及
IgE水平均有所降低（P<0.05）。2）HE形态学改变：与对照组相比，AR模型组黏膜表面纤毛上皮层增厚，上皮
细胞有变性或脱落改变，黏膜下腺体增生，排列紊乱，间质大量炎细胞浸润，毛细血管扩张、充血；与AR模型组
相比，玉蝉卫肺丸组与氯雷他定组大鼠鼻黏膜上皮损伤程度明显减轻，上皮层次较清楚，黏膜下腺体增生不明
显，毛细血管轻度扩张充血，少量炎细胞浸润。其中，玉蝉卫肺丸组在减缓鼻黏膜上皮细胞损伤方面作用更明
显。3）肥大细胞免疫组化染：与对照组相比，AR模型组肥大细胞在黏膜组织内分布广泛，数量增多；与AR
模型组相比，玉蝉卫肺丸组与氯雷他定组肥大细胞分布与数量均有不同程度的减低。结论玉蝉卫肺丸可以
减低变应性鼻炎模型大鼠嗜酸粒细胞数量及IgE水平，改善鼻黏膜组织损伤，降低黏膜内肥大细胞的表达。
【关键词】变应性鼻炎玉蝉卫肺丸鼻黏膜组织肥大细胞大鼠
Effect of Yuchan Weifei Pills on the Expression Eosinophils，IgE Levels and Mast Cell of Nasal Mucosa in
Allergic Rhinitis Rats Yang Bin，Sun Taoyu，Liu Zhen，Cui Ye，Xu Chunying.Xiyuan Hospital，China Academy
of Chinese Medical Sciences，Beijing100091，China.
【Abstract】Objective：To explore the effect of Yuchan Weifei Pills on the expression of eosinophils，IgE levels
and the number of mast cells in the nasal mucosa of rats with allergic rhinitis（AR）.Methods：32male SD rats
were randomly divided into the normal control group（8rats）and the remaining as the model groups，namely the
AR group，Yuchan Weifei Pills group，loratadine tablet group（loratadine group），8rats in each model group.The
model groups were established by intraperitoneal administration of OVA andg Al（OH）3，and atomized1％OVA to stimulate the nasal mucosa.Then they were given drug treatment respectively.Wright staining was used to detect
the number of eosinophils in nasal secretions，the level of IgE in serum was detected by ELISA，the histopathologi⁃
cal changes of nasal mucosa were observed by HE staining，and the expression level of mast cells
in nasal mucosa
was detected by immunohistochemistry.Results：1）Number of eosinophils and IgE level：compared with the nor⁃
mal group，the number of eosinophils and the level of IgE expression in the AR group increased；compared with
the model group，the number of eosinophils and the level of IgE in the Yuchan Weifei Pills group and the lorata⁃
dine group decreased.2）HE staining of morphological changes：compared with the normal control group，AR
group showed thickening of ciliated epithelial layer on the surface of mucosa，degeneration or shedding of epitheli⁃
al cells，hyperplasia of submucosal glands，disorder of arrangement，infiltration of a large number of inflammatory
cells in the stroma，capillary expansion and congestion.Compared with the model group，Yuchan Weifei Pills group
and loratadine group showed less epithelial damage，clear epithelial layer，less submucosal gland hyperplasia，mild
∗基金项目：国家自然科学基金项目（81704120）；中国中医科学院西苑医院苗圃课题（2019xymp-06）
△通信作者（：*************）
变应性鼻炎（AR）是变应原刺激下IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎症。流行病学调查显示，我国城市AR患病率平均为11.1%，全球AR患者人数超过5亿［1］。AR如未得到有效控制，可导致鼻窦炎、哮喘等疾病发生［2］，因此对AR患者进行有效干预，对防止其恶化具有重要意义。玉蝉卫肺丸是西苑医院院内制剂，具有补气健脾散风之功，临床上取得了较好的疗效［3-4］。本研究通过观察AR大鼠鼻腔分泌物中嗜酸粒细胞数量、血清IgE水平、鼻黏膜组织病理改变以及肥大细胞表达，探究玉蝉卫肺丸对AR的作用。
1材料与方法
1.1实验动物32只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，4~6周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0001。大鼠饲料喂养，自由饮水，室温（22±2）℃，湿度（55±15）%，并通过本院动物实验伦理研究委员会同意。
1.2试药与仪器玉蝉卫肺丸，由黄芪、玉竹、蝉衣、防风、白芷组成，生药量4.25g/丸，院内制剂号：京卫药制字（087）第F-1246号。氯雷他定片（西安杨森，10mg/片，批号：050218967）。卵清蛋白（OVA）（批号A5253-1009，Sigma），氢氧化铝凝胶［Al（OH）3］（批号A8222-250，Sigma），MC小鼠单克隆抗体（货号ab2378，Abcam），酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（批号1919D0516，中杉金桥）。全自动多功能酶标仪（ASP300，Thermo），全自动脱水机（TP1020，Leica），组织切片机（RM2235，Lei⁃ea），光学显微镜（BX53，Olymplus），Image-Pro Plus6.0（Media Cybernetics）。
1.3分组与造模1）分组：采用随机数字表法，32只SD大鼠分为对照组、AR模型组、玉蝉卫肺丸组、氯雷他定组，每组8只。2）造模：除对照组外，其余各组按照文献方法制备AR大鼠模型：致敏阶段给予大鼠腹腔注射卵清蛋白+抗原佐剂混悬液［0.3mg OVA和30mg Al（OH）3］溶于1mL0.9%氯化钠溶液，隔日1次，共14d。激发阶段从第15天开始，双侧10％OVA生理盐水溶液滴鼻，每侧50μL，连续滴鼻7d。鼻腔激发后30min内，观察大鼠喷嚏个数、流涕分泌量及搔鼻次数，采用叠加量化法记录评分，当评分≥6时，表明造模成功［5-6］。1.4干预方法造模成功后，根据体表面积法换算，玉蝉卫
肺丸组剂量500μg/kg，中药溶于蒸馏水灌胃，每日1次，氯雷他定组剂量1.25mg/kg，每日1次，对照组及AR模型组等量生理盐水灌胃，连续用药10d。1.5标本采集与检测1）Wright染检测鼻腔分泌物嗜酸性粒细胞：鼻腔分泌物涂片，95%乙醇固定，蒸馏水洗后平放于染盒内，滴加Wright染液覆盖涂片上细胞区域，再滴加等量缓冲液，轻轻摇动涂片充分混匀，镜下观察染情况，适时蒸馏水冲洗终止反应，再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后备检。200倍镜下观察并统计嗜酸性粒细胞个数。2）ELISA检测血清IgE水平：末次用药24h后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，1400g离心10min，分离血清，根据ELISA试剂盒说明书步骤检测血清IgE 水平。3）HE染检测鼻黏膜组织形态学改变：处死大鼠，统一取左鼻黏膜组织10%中性甲醛固定，右鼻黏膜组织冻存。组织固定后，常规脱水、包埋、切片，HE染，显微镜下观察各组鼻黏膜组织病理改变。4）免疫组化检测鼻黏膜组织内肥大细胞的表达：石蜡切片制作为4μm厚度，脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高压热修复3min，10%H2O2室温封闭10min，PBS洗涤后加入一抗MC，浓度为1∶200，用PBS代替一抗做阴性对照，4℃孵育过夜，二抗室温孵育30min，镜下DAB显、苏木精复染、梯度酒精脱水、封片。在光学显微镜200倍下，每切片选取3个高倍视野，拍摄鼻黏膜组织图像。医学图像分析软件（Image Pro-plus6.0）分析测定每张图像的积分光密度值。
1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示。两组间比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞及血清IgE水平比较见表1。Wright染检测中，嗜酸性粒细胞被染为红，其细胞质内可见多量紫红嗜酸性颗粒样物质。与对照组比较，AR模型组大鼠鼻腔分泌物内嗜酸性粒细胞数量增多，血清IgE水平增高（P<0.05）。各用药组与AR模型组比较，两指标均有下调（P<0.05），其中玉蝉卫肺丸组嗜酸性粒细胞减少较明显。
capillary expansion and congestion，and a small amount of inflammatory cells infiltration.Yuchan Weifei Pills group had a more obvious effect on alleviate the damage of nasal epithelial cells.3）Immunohistochemical staining of mast cells showed that：compared with the normal group，the distribution of mast cells in the AR group was ex⁃tensive and the number was increased；compared with the AR group，the distribution and the number of mast cells in the Yuchan Weifei Pills group and the loratadine group were decreased.Conclusion：Yuchan Weifei Pills can re⁃duce the number of eosinophils and the level of IgE in allergic rhinitis model rats，improve the damage of nasal mucosa and reduce the expression of mast cells.
【Key words】Allergic rhinitis；Yuchan Weifei Pills；Nasal mucosa；Mast cell；Rats
2.2各组大鼠鼻黏膜组织病理学观察见图1。光镜下，空白组鼻黏膜上皮未见损伤，假复层柱状纤毛上
scr-035皮未见变性坏死、增生及萎缩，形态及结构完整，黏膜下层有少数充血，未见炎症细胞浸润及腺体增生。模型组鼻黏膜假复层柱状纤毛上皮明显增厚，杯状细胞增多，黏膜下腺体增生扩张，排列紊乱，黏膜下间质大量炎症细胞浸润、毛细血管明显扩张充血。玉蝉卫肺丸组较模型组大鼠鼻黏膜上皮损伤程度明显减轻，上皮层次较清楚，黏膜下腺体增生不明显，毛细血管扩张充血，水肿不明显，少量炎细胞浸润。氯雷他定组鼻黏膜破损减轻，上皮层次较清楚，黏膜下层腺体轻度减少，毛细血管扩张充血水肿，少量炎性细胞浸润。
2.3各组大鼠鼻黏膜组织内肥大细胞表达见图2。
免疫组化结果显示：肥大细胞胞浆呈黄至棕黄阳性颗粒，界限清楚，背景清晰。肥大细胞主要存在于大鼠鼻黏膜组织黏膜及黏膜下层，部分肌层亦见表达，以前二者为主要表达部位。对照组高倍镜（200倍）视野下平均肥大细胞数为（28.60±4.50）个，与对照组比较，AR 模型组大鼠鼻黏膜组织内肥大细胞蛋白表达增高，平均肥大细胞数为（59.60±8.80）个（P <0.05）；各用药组与AR 模型组比较，肥大细胞数均有不同程度的下调，玉蝉卫肺丸组为（44.80±6.10）个（P <0.05），氯雷他定组为（48.10±5.30）个（P <0.05）。
3
讨论
AR 为非感染性的免疫炎症疾病，流行病学调查显
示，全球40%的人口有AR 相关症状，已成为全球性的健康问题［7］。近年来我国AR 患病率急剧上升，标准化患病率从2005年的11.1%上升到2011年的17.6%［8］。
变应性鼻炎属于Ⅰ型变态反应，机体在外界抗原的刺激下，诱导鼻黏膜或者局部淋巴组织产生过多的IgE ，可与相应细胞（主要为肥大细胞）表面的IgE 受体结合，活化肥大细胞分泌组胺或白三烯等炎性介质。这些炎症介质诱导黏膜上皮细胞或者血管内皮细胞分泌细胞因子、趋化分子及黏附分子，不仅造成炎症的进一步加剧，而且还可以趋化募集并活化嗜酸粒细胞及Th2细胞［9］。最新的研究发现，肥大细胞在AR 的发生发展过程中不仅仅是分泌炎症介质的“效应剂”，它与鼻黏膜上皮细胞［10］以及神经细胞［11］可存在交互作用，在调节上皮细胞完整性及神经敏感性方面都发挥相关作用。因此，血清IgE 水平、嗜酸粒细胞及肥大细胞数量均为衡量AR 严重程度的关键指标。笔者实验显示：玉蝉卫肺丸和氯雷他定能显著降低AR 大鼠血清IgE 水平，抑制嗜酸粒细胞及肥大细胞的活化与增生；同时发现，玉蝉卫肺丸组在降低AR 大鼠嗜酸粒细胞及肥大细胞数量方面优于氯雷他定组。
AR 主要病理变化为黏膜上皮变性、损伤，黏膜下腺体增生，毛细血管扩张、出血、水肿，神经纤维增生活化及间质炎症等［12］。其中，上皮、血管及神经病变是造成鼻塞、鼻痒及流涕的病理基础，而反复炎症及修复的过程会刺激鼻腔黏膜发生鼻息肉、鼻窦炎。本次实验发现，玉蝉卫肺丸可以修复
鼻黏膜上皮损伤，减缓黏膜下腺体及血管增生，减少水肿，控制炎症，有效改善鼻黏膜组织损伤，纠正疾病状态。
表1
各组大鼠鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞及血清IgE 水平比较
（x±s ）
与对照组比较，∗P <0.05；与AR 模型组比较，△
P <0.05
组别对照组AR 模型组玉蝉卫肺丸组氯雷他定组
n
8888
EOS （个）
3.51±1.07
14.24±3.55*8.02±1.68△
9.44±2.24
减压蒸馏IgE （μg/mL ）40.26±5.6198.46±11.04*69.72±7.05△73.83±7.96
△
对照组AR 模型组
玉蝉卫肺丸组氯雷他定组
图1各组大鼠鼻黏膜组织形态学改变（HE 染，200倍）
对照组AR 模型组
玉蝉卫肺丸组氯雷他定组
图2
各组大鼠鼻黏膜组织内肥大细胞表达
（免疫组化染，200倍）
（下转第2091页）
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（收稿日期2020-07-22）
AR在中医学属于“鼻鼽”范畴，多数学者认为鼻鼽的发生因虚致病者为多，内因多为脏腑功能失调，外
因寒邪和异气之邪为其诱发因素，主要与肺、脾、肾诸脏有关。玉蝉卫肺丸经过中国中医科学院西苑医院耳鼻喉科几代人的临床验证，取得了较好疗效，得到广大患者认可。其成分为黄芪、玉竹、蝉蜕、防风、白蒺藜、辛夷、白芷等。方中君药为黄芪、玉竹，臣药为蝉蜕、防风，黄芪、玉竹有补益肺脾，提高机体免疫力的作用，蝉蜕、防风、蒺藜可疏散风邪、息风止痉，有抑制免疫与抗过敏作用，全方可改善脏腑功能，外散风邪［13-14］。
综上所述，玉蝉卫肺丸可以减轻AR大鼠鼻黏膜组织破坏，降低血清IgE水平，减少嗜酸粒细胞及肥大细胞的趋化，显著改善AR大鼠的炎症及损伤，初步证明了其对肥大细胞和嗜酸性粒细胞有广谱抑制活性，可认为其是抵抗抗原诱导的气道炎症反应的有效保护剂。本研究提供了玉蝉卫肺丸针对AR西医学的病因的理论基础。但在AR研究方面仍有许多值得研究的领域，如中药改善鼻黏膜组织损伤的具体分子机制，抑制肥大细胞活化的作用方式？肥大细胞与鼻黏膜上皮之间是否存在交互作用？这些具体的作用机制还需要我们做进一步的深入研究。
拉丝模
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（收稿日期2020-03-01）
（上接第2083页）
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