•2904 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年5月第36卷第5期CJTCMP，May2021，Vol.36, No.5
刘星、孙梦瀛2，薛江源\李艳荣' 樊慧杰2，柴智2
U山西中医药大学中药与食品T.程学院，晋中030619 ;2山西中医药大学基础医学院/
神经生物学研究中心，晋中030619)
摘要：目的：探究五子衍宗丸（W Y P)对双环己酮草酰二腙（C P Z)诱导的脱髓鞘模型炎症反应的抑制作用方法：27只S P F级C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组和W YP组，每组9只。模型组和W YP组饲喂含有 0.2%CPZ的饲料，空A组饲喂正常饲料，共6周，于第2周末，WYP组给予WYP药液（丨68*1<；卜1*十|)灌胃，空白
组和模型组灌胃等f t0.9%.氯化钠溶液，每日2次，共4周.卢卡斯快蓝染观察各组脑组织脱髓鞘程度并计算平均
容积式热水炉
积分光密度值，实时荧光定量PC R法检测脑组织白细胞介素（I L) -6. IL-1P和肿瘤坏死因子（T N F-a)的基因 表达S t ELISA法检测脑组织丨L-4的含量结果：与空白组比较，模铟组肼胝体蓝染着浅，组织结构不致密=
与模型组比较，W Y P组肼紙体蓝染着加深，组织结构相对紧密。与空白组比较，模型组平均积分光密度值显
著降低（PcO.Ol ),IL-6、IL-1P和TN F-a的基因表达量显著升高（ZkO.O l,P<0.05) ,IL-4的含量呈降低趋势。
与模铟组比较，W YP组平均积分光密度值显著升高（P<0.01 ),IL-6, T N F-a的基因表达量显著降低（/V0.01,
P<0.()5)，丨L-i p的基因表达量呈降低趋势，丨L-4的含量呈升高趋势结论：W YP对脱髓鞘模型小鼠有促进再髓鞘
化的作用，其机制可能与降低炎症因子分泌进而改善炎性环境有关。
关键词：五子衍宗丸；双环己酮草酰二腙；炎症因子；抑炎；髓鞘修复；脱髓鞘；多发性硬化
基金资助：国家然科学基金项目（N o.81703978, N o.81102552 )，中央引导地方科技发展资金A由探 索类基础研究项目（N〇.YD ZX20201400001483 )，山西省青年拔尖人才支持计划项目（N o.晋组办字〔2019〕
35号文），山西宵白然科学基金项目（N〇.20190U)I11334 )，山西省留学回国人员科技活动项目择优资助
项B(N o.20200026 )，山西省重点研发计划项0(N n.201803D3l209)，山西柯高等学校科技创新计划项目
(N〇.2019L0724 )
Inhibition effects of Wuzi Yanzong Pills on demyelination model inflammatory response L I U X i n g1. S U N M e n g-y i n g2, X U E Jiang-yuan1, LI Yan-r o n g:, F A N Hui-jie2, C H A I Z h i2
33dxdx('College of Traditional Chinese Medicine and F〇(xl Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine. Jinzhong 030619.
China; ^College of Basic Medical Sciences/Research Center for Neurobiology, Shanxi University of
Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China )
A bstract: Objective: To explore the effects of Wuzi Yanzong Pills (WYP) on the inflammatory response of
demyelination model induced by cuprizone. Methods: A total of 27 SPF grade C57BL/6 mice were randomly divided into normal
group, model group and WYP group, with 9 mice in each group. The model group and the WYP group were fed with containing
0.2% cuprizone. and the normal group was fed with normal feed, both for 6 weeks. On the second weekend, WYP group was given
the WYP solution 16g • kg 1• d 1by gavage, the normal group and the model group were gavage with the same amount of normal
saline twice a day, both for 4 weeks. Luxol fast blue staining was used to observe the demyelination degree of brain tissue in each
group and calculate the average integral optical density value. Real-time fluorescence quantitative PCR method was used to detect
the gene expression of interleukin (IL)-6, IL-1 p and tumor necrosis foctor (TNF- a) in brain tissue. ELISA method was used to
detect the content of IL-4 in brain tissue. Results: Compared with the normal group, the corpus callosum of the model group was
lightly stained and the tissue structure was not dense; compared with the model group, the corpus callosum of the WYP group was
通信作荇：柴智，山西省晋中市高校园区大学街121号山西中医药大学基础医学院/神经生物学研究中心，邮编：030619
电话E-mail:
stained darker and the tissue structure was relatively tight. C o m p a r e d with the normal group, the average integral optical density value of the model group decreased (PcO.Ol)，the gene expression of IL-6, IL-1 p and T N F -a increased (PcO.Ol，
the
content of IL-4 s h o w e d d o w n w a r d tremd. C o m p a r e d with the model group, the average integrated optical density value of W Y P group increased (尸<0.01)，and the gene expression of IL-6 and T N F - c x decreased (P<0.01，尸<0.05)，the gene expression of IL-1 (3 sho w e d d o w n w a r d trend, the content of IL-4 showed upward trend. Conclusion: W Y P can promote remyelination in mice with demyelination. T h e m e c h a n i s m m a y be related to reducing the secretion of inflammatory factors and improving the inflammatory environment.
K e y W o r d s : W u z i Y a n z o n g Pills; Cuprizone (CPZ); Inflammation factor; Anti-inflammation: My e l i n repair;
Demyelination; Multiple sclerosis (M S )
F u n d i n g : National Natural Science Foundation of China (N 〇.81703978, N o.81102552)，Central Gover n m e n t Guided
Local Funding Projects for Science and Technology D e v elopment (N o.Y D Z X 20201400001483)，Outstanding You t h Talents Program of Shanxi Province (No.[ 2019) 35), Natural Science Foundation of Shanxi Province (N 〇.201901D 111334), Returned Chinese Scholars Technology Activities Preferred Project of Shanxi Province (No.20200026), K e y R &D Projects of
Shanxi Province (N 〇.201803D31209), Shanxi University Science and Technology Innovation Project (N 〇.2019L0724)
多发性硬化（m ultiple sc le ro s is , M S )属于自身免疫性疾 病，因其病灶多、易复发、不易缓解的特点，成为青年人非创 伤性神经功能障碍的主要疾病。发病人以女性居多，主要 临床表现涉及味觉、视觉、感觉和运动障碍等方面，极大降低 患者的生活质量，对患者的自理能力产生影响111 MS 的主要病 理特点是脱髓鞘m ，病理变化主要与炎症反应相关13]。因而， 抑制炎症反应可减缓MS 疾病的进展和病程。目前MS 西 医以免疫抑制剂为主，通过调控免疫反应控制病情|41，但因西 药不良反应多，患者服药依从性低，较难达到较好的效 果。中医药在结合患者临床证塱基础上辨证用药，临床观察 疗效较好[51。五子衍宗丸（W Y P )具有补肾益精的功用，可减 轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的炎症反应改善临床评分 抑制帕金森病小鼠脑内炎症因子水平，保护黑质多巴胺能神 经元，进而改善模型小鼠的行为学m ，提示在降低炎症上WYP 有潜力。本文从炎症角度探究W Y P 对脱髓鞘的作用及其 机制。
材料与方法1.
动物SPF 级雄性C 57BL /6小鼠27只，8~丨0周龄，体质量 18~20g ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物 许可证号：SCXK (京）2016-0006:：提前在无病原菌的动物房 适应性词养1周，动物自由饮食、进水和活动，室内光照充足，明 暗循环为i 2h /i 2h ，温度维持在湿度适宜。
电机定子测试台
2.
药物 W Y P ，水蜜丸，购自山西太原市同仁堂药店 (生产商：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：20035036)，成人用量为日服2次，每次6g ，成分为枸祀子、英丝 子（炒），覆盆子、五味子（蒸）、盐车前子。将药丸用中药材研 磨机充分粉碎成微细粉末，按照16g _kgq
剂f i ，溶于0.9%氯
频率补偿电路化钠溶液充分溶解配制成〇.32g /mL 的药液|61，置于代冰箱，用 前加热并充分混匀。
3. 试剂与仪器双环己酮草酰二腙（Cuprizone , C PZ ，批
号：BCBV 3777)购自Sigm a 公司；水合氯醛（批号：20170501) 购自天力化学试剂有限公司；多聚甲醛（批号：20180505)购自 光复科技发展有限公司；溶剂蓝38 (批号：20180515)购自索莱 宝公司；碳酸锂（批号：C 10104162)购自麦克林公司；无水乙醇 (批号：20190905)、二甲苯（批号：20190504)均购自天津市 大茂化学试剂厂;RIPA 裂解液（批号：N 〇.061919190814)购自碧 云天生物技术有限公司；TriQ uirk Rpagent 总RNA 提取试剂（批 号：m i 00)购自索莱宝公司；反转录试剂盒（批号：RR 047A )、 荧光定量试剂盒（批号：R R 820A )均购自T akara 公司；白细胞 介素（interleukin , IL )-4 ELISA 试剂盒（批号：P 202748)购自 R&D systems 公司。
冰冻切片机（L e ira 公司，型号：C M 1850)、正置显微镜 (L eica 公司，型号：DM 4000B /DFC 450C )；高速冷冻离心机 (T herm oF ishpr 公司，型号：M ultifuge X 1R )；实时焚光定S PC R 仪（Bio -R ad 公司，型号：CFX 96T M )；酶标仪（M olercular Dpvires 公司，型号：SpectraMax Plus 384)。
4.
造模与给药实验动物采用随机数字表法分为空白
组、模型组和W Y P 组3组，每组9只将动物词料打碎成末，在
词料中以0.2%比例掺人C PZ 药物，充分混匀制作成饼干状，于 阴凉处风干后食用空白组饲喂正常词料6周，模型组和W YP 组词喂含CPZ 词料6周。于第2周末，W YP 组小鼠灌胃W YP 药液 16g *k f _d '空白组和模型组灌胃0.9%氯化钠溶液0.5m L ，3组
每天分别灌胃2次，
共4周。5.
观察指标与方法饲喂第6周末处死小鼠。10%水合氯
醛（lOm L/kg )腹腔注射进行麻醉，掐尾观察无反应视为麻醉 完全，打开腹腔和胸腔。随机选取3只小鼠制作脑组织冰冻切 片先用0.9%氯化钠溶液进行心脏灌注直至肝脏无血，再灌 注4%多聚中醛进行固定，置于冰上取出完整脑组织，放置于 4%多聚甲醛中低温固定2h ，再于30%蔗糖溶液中脱水24h 。OCT (optim al rutting tem perature com pound )包埋后放置于液氣中
空白组
模型组 W Y P 组
图1
各组小鼠脑组织脱髓鞘程度比较«=3>
注：A .卢卡斯快蓝染图（x 200) ; B .各组平均积分光密
度值柱状图。与空白组比较/><〇.〇1；与模型组比较，AaP <〇.〇l
2.
W Y P 对小鼠脑内IL -6、IL -i p 和T N F -a 基因表达的
影响见阍2。与空白组比较，模型组炎症因子IL -6、IL -i p 和 TNF -ot 基因表达量均显著上升（P cO .O I , P <〇.〇5)。与模型组
比较，W YP 组IL -6、TNF -a 基因表达量均显著下降（PcO .O l , 尸<0.05>, IL -丨卩呈下降趋势.
空f l 组
««组WYP 组 空内组校S S WYP® 空内组模S 组WYP 组
阁2
各组小鼠脑内炎症因子基因表达f t 的比较«=3)
注：与空白组比较，’P <〇.〇5, ‘><0.0丨；与模型组比较，
说明书，每孔加人适量的样品或标准品，室温孵育2h 后弃去 再清洗.加人丨〇〇txL 检测抗体，室温孵育2h 后清洗每孔中加 人10CVL 链酶亲和素-H R P T .作液，室温孵育20m in ，避免阳光 直射。每孔加人lOO ^L 底物溶液，室温孵育20m in -_，每孔加入 50jjl L 终止液，轻震以充分混合，人酶标仪检测450n m 处吸光 值根据标准孔的吸光度值做标准曲线，计算样品的1L -4浓度
6.统计学方法采用GraphPad Prism 6.0统计软件进行数据 分析，计M 资料符合正态分布用遠示，采用单因素方差分析 比较组间差异，以PcO .05为差异有统计学意义
结果1.
W YP 对小鼠脑组织脱髓鞘程度的影响见图1。卢卡斯
快蓝染结果®.示，空白组胼胝体区域蓝染颜较深，且组织 致密饱满，结构紧凑:，模型组蓝染斑驳且颜较浅，组织结构 连接不甚紧密，有空洞出现。与空白组比较.模型组平均积分光 密度值ffi 著降低（户<〇.〇1)W Y P 组蓝染颜加深，较模型组 着较为均匀.相对模型组结构紧凑，空洞较少，平均积分光密 度值较模铟组a 著升高（p <〇.〇i )
•
、-v 二 / V 滅
空(4绀 模型组 W YP 组
制成组织块，在切片机上制备成冠状冰冻切片剩余6只 心脏灌注0.9%氯化钠溶液后，取出完整脑组织，其中3只称重后 置于离心管中低温保存，另外3只称重后放置于加人裂解液的 研磨器中，充分研
磨直至组织完全成为液体，丁-低温离心机中 12 000r/min (离心半径5cm >离心30min ，小心吸取上清液保存。
5.1卢卡斯快蓝染观察脱髓鞘程度冰冻切片置于溶剂 蓝38溶液中60尤浸泡12〜18h ，冉没于95%乙醇溶液放置在摇床 上清洗，在碳酸锂溶液和75%乙醇溶液中分化，直至灰质和白 质清楚分辨，放置于蒸馏水中洗去多余溶液，梯度乙醇溶液脱 水，二甲苯固定。自然晾干后中性树胶封片观察，用Im age-Pm Plus
6.0计算胼胝体区域平均积分光密度值
5.2实时荧光定量PCR 法检测炎症因子化-6，丨L -i p 和肿瘤 坏死因子（tumor necrosis farto r-a , TNF-CX >的基因表达将消 毒研磨碗中加人液氮，将各组小鼠脑组织称重后放入研磨碗 中，充分研磨，在研磨过程中适时添加液氮直至组织研磨成 粉末_将研磨好的组织倒人lnil .RNA 提取试剂中，12 000r/niin (离心半径5r m )离心5m i n 吸取L 清液加入20(V L 氯仿，涡旋 混勾冰上静置5min 12 000r/min (离心半径5i .m )离心15m i n 吸
取上层液体加人400m i L 异丙醇，充分涡旋混匀，室温静置lOmin 后，41条件下12 000r/min (离心半径5cm )离心lOmin ，倒掉1?凊 液：按照lmLKNA 提取试剂裂解的样品中加人lm L 75%乙醇，充 分混匀后4*C 条件下12 000r/min (离心半径5cm )离心5m in 。弃掉 上清液，在室温条件下干燥2~3m in :.
在Ep 管内加人20(xL 无RNA 酶的水使其溶解:•参照反转籴试剂盒说明书，将RNA 反转录成 (•DNA ..再参照荧光定量试剂盒说明.以2(V L 为反应体系，加人 上下游引物（引物序列见表1 )、样品和其他反应溶液，充分混匀 后，人荧光定量仪，按照公式计算IL -6, IL -i p 和TNF -c (的 mRNA 相对表达水平。
表1
实时荧光定S P C R 引物序列
名称序列（5’-3’）
长度（bp )
IL -6
正向:ACC AGA GGA AATTTT CAA TAG GC 139
反向:TGA TGC ACT TGC AGA AAA CA
IL -1(3
正向:GAA GA A GAG CCC ATC CTC TG 164反向:TCA TCT C(；G AGC CTG TAG T (；
TNF-a
正向:AGG GTC TG C ；
GCC ACA GAA CT 258
反向:CCA CCA CGC TCT TCT GTC TAG
GAPDH 正向:ATC CTG CAC CAC CAA CTG CT
132
反向:GGG CC A TCC AC
A GTC TTC TG 5.3
E L 1SA 法检测抑炎内子IL -4的含量测定各组蛋A 提
取液的蛋白浓度，使用试剂盒内的样品稀释液调成统一浓度 在96孔板上的加样孔内加人100(jl L 捕获抗体，并在室温下畔 育过夜，隔天弃去孔内液体，加人洗涤液充分清洗3次按照
3.
W YP 对小鼠脑内IL -4含量的影响见图3。与空白组比 较，模型组IL -4的含量呈下降趋势。与模型组比较，W Y P 组 IL -4的含量呈上升趋势，但差异均无统计学意义。
图3各组小鼠脑内抑炎因子IL -4含量比较«=3)
讨论
中医学中并无MS 病名，据其症状表现，临床上多将其归于 “痿症”“肌痹”“青盲”等范畴。病机正虚为本，邪实为标，邪 实多为痰浊、热毒、瘀血、水湿，病位主要在脑，累及诸脏，以 肾为主。临床经验发现，补肾方药在MS 疾病中效果较好， 以滋补肝肾药和补气化痰通络药物配伍居多|81。在实验性自身 免疫性脑脊髓炎中证实，补肾药可减轻炎症反应改善临床症 状^。滋阴和温阳补肾方药通过影响淋巴细胞亚的免疫反应 减轻炎症1"11。同时，补肾法的还可提高患者的生活质量， 改善神经功能障碍11 "。W Y P 以补肾为主，方中君药为菟丝子和 枸杞子，菟丝子为补脾、肾、肝三经要药，枸杞子为补益肝肾真 阴不足之要药，二者益阴扶阳，共同补肾益精臣药为五味子和 覆盆子，五味子酸敛固涩，覆盆子益肾固精，酸甘相合共同固 肾涩精。佐使药为车前子，补肾同时利尿泻热。五药相合，补肾 之功更佳。W Y P 中的部分化合物，如槲皮素和山柰酚具有抗炎 作用|121。还可通过调控凋亡蛋白和基因的表达，抑制细胞凋亡， 扭转疾病进程|13_141。
MS 主要病理表现是炎症浸润、少突胶质细胞凋亡、髓鞘脱 失，其后引发一系列临床症状。因而MS 的关键在于减轻炎 症反应，进而抑制少突胶质细胞凋亡，保护髓鞘|151。C PZ 主要 作用耙点是中枢神经系统的少突胶质细胞，其毒性作用可使少 突胶质细胞发生凋亡，髓鞘失去其包绕慢慢剥落暴
露轴突|161。 CPZ 模型模拟了MS 患者脑内脱髓鞘的现象：电镜中发现词喂 CPZ 后，中枢神经系统中髓鞘纤维脱失增多，髓鞘层间出现裂 隙|17]。卢卡斯快蓝染结果显示，CPZ 词喂小鼠胼胝体髓鞘丟 失严重，经W Y P 干预后髓鞘脱失得到改善，提示WYP 可减轻脱 髓鞘程度3剥落的髓鞘碎片会诱发小胶质细胞激活，聚集于脱 落部位并分泌炎症因子[181。在MS 的病理变化中，中枢神经系统 的炎症反应多与小胶质细胞分泌的细胞因子有关|191。小胶质细 胞活化后会分泌炎症因子IL -6和IL -1 p ，进一步加重髓鞘脱失，
不利于髓鞘再修复|2<>|。大脑皮层和海马区域IL -1 (J 和TNF -a 的
异常升高，极大限制髓鞘再生过程|211。本实验结果中，模型组 脑组织炎症因子丨L -6、IL -i p 和TNF -a 基因表达量升高，同已 有实验研究结果一致，表明C PZ 小鼠脑内炎性环境加剧：同时 W YP 干预后，IL -6、IL -i p 和TNF -a 基因表达下降，提示干预治 疗后减轻了炎性浸润。IL -4作为抑炎因子，在中枢神经系统中表 达增加有助于对抗炎性环境，促进髓鞘修复1221。IL -6和IL -1P 分 泌减少,IL -4分泌增加后，再髓鞘化程度可明显增强，并能进一 步挽救运动功能缺陷。提示炎性环境的改善对于髓鞘修复和再 髓鞘化具有重要作用|231。在本研究中，脑组织内1L -4的含量呈 升高趋势，提示W YP 干预有可能会诱导抑炎因子的分泌增加，
通过平衡抑炎因子和炎症因子改善中枢神经系统的炎性环境。
螺母热熔机
综上所述，W YP 通过降低炎症因子IL -6、丨L -i p 和T N F -a 的分泌，影响抑炎因子丨L -4的表达，改善脑内炎症反应加剧，修 复受损髓鞘，促进髓鞘再生，进而改善CPZ 诱导模型脱髓鞘.:，
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(收稿日期：2020年6月9日）
•研究报告•
白术根腐病病原菌的分离鉴定及特性研究
黄幸鹤，李美芽，杨蒋舜，宋腾蛟，袁小凤
(浙江中医药大学，杭州310053 )
摘要：0的：分离A术根腐病病原菌，探究温度和pH值对病原菌生长状态的影响：方法：采用组织分离法分 离、纯化得到病原菌，致病性试验判定其对白术的致病性。通过分子生物学鉴定病原菌的种属、，分别采用不同的 温度和|化值探究不同条件对病原菌生长的影响结果：14术根腐病病原菌为尖孢镰刀菌（/；'«.«^'!^〇吵^〇/1洲）。
在温度超过SOT., p H值为卯寸尖孢镰刀菌生长缓慢，结论：温度和pH值都会对尖孢镰刀菌的生长产生影响.，关键词：白术；根腐病；尖孢镰刀菌；温度；pH值；分离；鉴定；特征
基金资助：国家自然科学基金面上项0(N〇.8187295l)
Isolation, identification and biological characterization of the pathogenic fungus for
Atractylodes macrocephala Koidz.
HUANG Xing-ge,LI Mei-ya,YANG Jiang-shun,SONG Teng-jiao,YUAN Xiao-feng
(Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China )
Abstract! Objective: Pathogenic fungus of root rot of A tra ctylo d es m a cro cep h a la Koidz. was isolated to explore the effects of tem perature and pH on its grow th status. Methods: Pathogenic fungus of root rot was isolated by tissue separation m ethod. E xploring the pathogenic effect o f isolated strain on A tr a c ty lo d e s m a c r o c e p h a la Koidz. through pathogenicity
通信作者：袁小凤，浙江宵杭州市滨江区滨文路548号浙江中医药大学生命科学学院，邮编：310053，电话：*************
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