一种羧甲基化酵母多糖海绵及其制备方法和应用

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种羧甲基化酵母多糖海绵及其制备方法和应用。

背景技术：

2.手术过程中出血可导致多种不良反应，包括增加输血需求，低血容量休克和低温凝血病。因此，快速止血在创伤手术或长时间手术过程中具有重要意义。止血是一种生理过程，也是伤口愈合的第一阶段，通过形成血块使受损血管停止出血。但是，大多数因外伤或手术引起的大出血通常是难以控制的，因此，就需要外用止血剂防止血液大量流失从而危及生命。目前，止血剂的研究通常集中在天然多糖、生物蛋白大分子以及无机粒子上，并且已有多种止血剂被用于临床，如surgicel、celox、hemcon绷带和mrdh等。然而，面对当下躯干、动脉和腔内出血引起的大量血液流失合并高血压的严峻挑战，现有的止血剂缺乏足够的组织粘连性能、吸收速度较慢，导致其难以满足这些需求。此外，止血过程中的抗感染能力通常是被忽视的，而伤口的持续感染会造成难以估量的损失，如截肢、脓肿形成和伤口愈合时间延长等。因此，迫切需要开发新型适用的抗感染止血剂，使其能够快速有效地控制大出血。
3.天然多糖是一种可再生生物医用材料，已被广泛应用于临床研究中。其中，在止血方面，壳聚糖以其优越的生物相容性、低毒及低致敏性、生物可降解性、抗菌活性、组织黏附性和止血活性而备受青睐。壳聚糖是一种由随机分布的d-葡萄糖胺和n-乙酰-d-葡萄糖胺组成的天然正电荷多糖，存在于壳聚糖多糖骨架上的氨基能够通过静电作用与细胞膜以及血流中的蛋白质相互吸引，从而导致强烈的血凝发生。然而，需要注意的是，固有阳离子特性的壳聚糖容易诱发溶血效应，造成血红蛋白外溢，导致持续炎症反应以及血栓形成。此外，海藻酸盐和卡拉胶也是两种常用于止血的天然多糖，但其本身不具备抗感染能力，因此，难以用于大出血中。
4.酵母多糖是一种天然多糖聚合物，存在于真菌细胞壁中，研究表明其能刺激人体的免疫系统，增强人体抵抗力，并能有效促进伤口的修复，具有极佳的生物降解功能。尽管如此，但是目前并未有一种酵母多糖产品被用于止血方面；可能的原因是单纯的酵母多糖难溶于水。基于此种考虑，羧甲基化的酵母多糖已被研制出来，但是，羧甲基化的改性也使得酵母多糖水凝胶原本的力学性能减弱或消失了，无法满足止血和应用中高强度的需求。因此，如何在保持良好的弹性和机械强度的前提下，使得羧甲基化酵母多糖体系具有良好可控的生物活性，是其在临床应用前必须要解决的关键技术问题。
5.气凝胶是目前已知的最轻固体材料，已被广泛用于工业生产。一般而言，气凝胶是一类密度较低及孔隙率较高的纳米材料，气凝胶的此种特性使得它能够吸收大量的水分。当前，将静电纺丝技术与气凝胶相结合，被认为是一种新型高强度海绵的制备策略。
6.静电纺丝纳米纤维具有高孔隙率、细胞外基质样结构、柔性组分和可延展的形态，在组织修复中表现出优异的性能，作为多功能伤口敷料的纳米级构建单元具有广阔的前
景。然而，将水溶性的羧甲基化聚合物进行静电纺丝，随后制备止血气凝胶依然是一个技术挑战。目前，尚未报道过静电纺丝止血气凝胶的研究。

技术实现要素：

7.为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，该制备方法简单、原料易得。
8.本发明的目的之二在于提供一种羧甲基化酵母多糖海绵，本发明中的海绵的质量轻便，力学性能优异，拥有充足的吸收伤口渗出液体的能力，弥补了目前止血水凝胶，纱布吸收血液能力不足的缺陷；同时能够与伤口组织产生极强的粘附能力，防止了止血过程中海绵的脱落；此外，该海绵还能激活体内免疫系统，抵抗感染的发生。
9.本发明的目的之三在于提供一种羧甲基化酵母多糖海绵在止血产品、抗感染药物或组织修复产品中的应用。
10.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
11.本发明的第一个方面在于提供一种羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，包括以下步骤：
12.将羧甲基化酵母多糖与高分子材料共混后静电纺丝，然后依次冷冻干燥、粉碎、均质，再冷冻干燥制得所述羧甲基化酵母多糖海绵。
13.优选地，所述将羧甲基化酵母多糖与高分子材料共混后静电纺丝的步骤具体为：将羧甲基化酵母多糖溶液和高分子材料溶液共混，然后静电纺丝。
14.优选地，所述羧甲基化酵母多糖溶液的浓度为2～5wt％；进一步优选地，所述羧甲基化酵母多糖溶液的浓度为2～4wt％；再进一步优选地，所述羧甲基化酵母多糖溶液的浓度为3～4wt％。
15.优选地，所述高分子材料溶液的浓度为10～15wt％；进一步优选地，所述高分子材料溶液的浓度为11～14wt％；再进一步优选地，所述高分子材料溶液的浓度为12～14wt％。
16.优选地，所述粉碎步骤为采用冷冻粉碎机磨成粉末。
17.优选地，所述均质步骤为将粉末与叔丁醇混匀并均质，制得浓度为50～100g/l的均质浆液。
18.优选地，所述高分子材料包括聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚己内酯中的至少一种。
19.优选地，所述静电纺丝条件为：电压为18.0～26.0ev；注射速度为0.1～0.5ml/h；接收器转速为：100～300rpm。
20.优选地，所述冷冻干燥为采用液氮冷冻干燥。
21.优选地，所述羧甲基化酵母多糖和高分子材料的质量比为1:(1～4)；进一步优选地，所述羧甲基化酵母多糖和高分子材料的质量比为1:(1～3)；再进一步优选地，所述羧甲基化酵母多糖和高分子材料的质量比为1:(2～3)。
22.优选地，所述羧甲基化酵母多糖的制备方法为：将酵母多糖与在碱性条件下混合反应，制得羧甲基化酵母多糖。
23.优选地，所述羧甲基化酵母多糖的制备方法具体为：将酵母多糖分散于异丙醇中，搅拌均匀，使用氢氧化钠溶液调节ph至碱性，加入反应，过滤收集滤渣，然后清洗，冻干，制得所述羧甲基化酵母多糖；进一步优选地，所述羧甲基化酵母多糖的制备方法具体
为：将酵母多糖分散于异丙醇中，搅拌均匀，制得浓度为2～5％的酵母多糖溶液，使用30～50wt％的氢氧化钠溶液调节ph至9～14，加入反应，过滤收集滤渣，然后清洗，冻干，制得所述羧甲基化酵母多糖；
24.优选地，所述使用氢氧化钠溶液调节ph至碱性具体为使用氢氧化钠溶液调节ph至10～13。
25.优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为30～40wt％；进一步优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为30～38wt％；再进一步优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为30～35wt％。
26.优选地，所述和酵母多糖的质量比为(1～4)：1；进一步优选地，所述和酵母多糖的质量比为(1～3.5)：1；再进一步优选地，所述和酵母多糖的质量比为(1～3)：1。
27.优选地，所述混合反应的温度为45～65℃；进一步优选地，所述混合反应的温度为50～60℃。
28.优选地，所述混合反应的时间为2～8h；进一步优选地，所述混合反应的时间为3～7h；再进一步优选地，所述混合反应的时间为3～6h。
29.本发明的第二个方面在于提供一种羧甲基化酵母多糖海绵，采用本发明的第一个方面提供的制备方法制得。
30.本发明的第三个方面在于提供本发明第二个方面提供的羧甲基化酵母多糖海绵在止血产品、抗感染药物或组织修复产品中的应用。
31.本发明的有益效果是：本发明中的制备方法将静电纺丝技术与气凝胶制备技术相结合，从而实现制备出一种同时兼具优异的力学性能和吸水能力的海绵，该制备方法简单、易操作，成本低廉、绿无污染，适用于大批量工业生产。
32.采用本发明中的制备方法制得的羧甲基化酵母多糖海绵，能够加速伤口止血，并能够调节巨噬细胞的吞噬作用，有利用抗感染的。此外，海绵中所采用的羧甲基化酵母多糖能够促进细胞的迁移，加速伤口的愈合。相较于现有技术中的壳聚糖止血剂而言，本发明中的羧甲基化酵母多糖海绵兼具优异的力学性能和吸水性能，同时具有更好的抗感染能力和加速成纤维细胞迁移的能力。
附图说明
33.图1为本发明实施例2和对比例1中的羧甲基化酵母多糖海绵的外形图。
34.图2为本发明实施例2和对比例1中的羧甲基化酵母多糖海绵的微观形貌图。
35.图3为本发明实施例2和对比例1中的羧甲基化酵母多糖海绵的力学性能图。
36.图4为本发明实施例2和对比例1中制得的海绵和celox
tm
的止血性能测试图。
37.图5为实施例2中的羧甲基化酵母多糖海绵生物相容性测试培养外形图。
38.图6为本发明实施例2中的羧甲基化酵母多糖海绵的溶血率测试图。
39.图7为红细胞被pbs和800μg/ml的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵处理后的sem图。
40.图8为本发明中的酵母多糖和羧甲基化酵母多糖的抗细菌感染性能测试图。
41.图9为本发明中的酵母多糖和羧甲基化酵母多糖的成纤维细胞迁移示意图。
42.图10为本发明中的酵母多糖和实施例1～4中的羧甲基化酵母多糖的紫外吸收图。
43.图11为一、酵母多糖和实施例1～4中的羧甲基化酵母多糖的红外吸收图。
具体实施方式
44.以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下若为有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
45.实施例1
46.本例中的用于快速止血的羧甲基化酵母多糖海绵，采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
47.(1)将100g酵母粉悬浮于500ml纯水中，加热煮沸，趁热过滤，收集滤液。随后将高温滤液静置，待温度降至室温后，酵母多糖完全析出，再次过滤，收集滤渣即为酵母多糖(yg)。
48.(2)将1g酵母多糖分散于20ml异丙醇中，以3000转/秒的速度搅拌均匀，随后缓慢滴加30wt％的氢氧化钠溶液(3g氢氧化钠溶于10ml去离子水中)，调节ph至12.0，继续搅拌30min。待酵母多糖大部分溶解后，加入1g一(cam)至反应液中，同时将反应温度调节至50℃，反应5小时结束。然后将反应液置于透析膜(截留分子量8000da)中，分别依次在5wt％碳酸氢钠水溶液和去离子水中透析48小时，之后冻干，即得到羧甲基化酵母多糖，记为cmyg-1。
49.(3)将0.5g羧甲基化酵母多糖(cmyg-1)和1g聚氧化乙烯(peo)加入到10ml去离子水中，搅拌过夜，得到澄清的peo/cmyg-1电纺液，随后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，纺丝条件为：正电压范围26.0ev，注射速度为0.5ml/h，接收器转速为150rpm。待电纺液使用完毕，得到基于羧甲基化酵母多糖的静电纺丝薄膜。
50.(4)将步骤(3)中得到的基于羧甲基化的酵母多糖静电纺丝薄膜使用液氮冷冻，并研磨成200目的电纺粉末。之后取1g电纺粉末置于200ml无水叔丁醇中，在30000rpm的条件下匀质均匀，随后将匀浆液倒入圆柱形模具中，在-80℃下冷冻，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h，即得本例中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵。
51.实施例2
52.本例中的用于快速止血的羧甲基化酵母多糖海绵，采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
53.(1)将1g酵母多糖分散于20ml异丙醇中，以3000转/秒的速度搅拌均匀，随后缓慢滴加30wt％的氢氧化钠溶液(3g氢氧化钠溶于10ml去离子水中)，调节ph至12.0，继续搅拌30min。待酵母多糖大部分溶解后，加入0.75g一至反应液中，同时将反应温度调节至50℃，反应5小时结束。然后将反应液置于透析膜(截留分子量8000da)中，分别依次在5wt％碳酸氢钠水溶液和去离子水中透析48小时，之后冻干，即得到羧甲基化酵母多糖，记为cmyg-2。
54.(2)将0.5g羧甲基化酵母多糖(cmyg-2)和1g聚氧化乙烯(peo)加入到10ml去离子水中，搅拌过夜，得到澄清的peo/cmyg-2电纺液，随后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，纺丝条件为：正电压范围26.0ev，注射速度为0.5ml/h，接收器转速为150rpm。待电纺液使用完毕，得到基于羧甲基化酵母多糖的静电纺丝薄膜。
55.(3)将步骤(2)中得到的静电纺丝薄膜使用液氮冷冻，并研磨成200目的电纺粉末。
之后取1g电纺粉末置于200ml无水叔丁醇中，在30000rpm的条件下匀质均匀，随后将匀浆液倒入圆柱形模具中，在-80℃下冷冻，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h，即得本例中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵。
56.实施例3
57.本例中的用于快速止血的羧甲基化酵母多糖海绵，采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
58.(1)将1g酵母多糖分散于20ml异丙醇中，以3000转/秒的速度搅拌均匀，随后缓慢滴加30wt％的氢氧化钠溶液(3g氢氧化钠溶于10ml去离子水中)，调节ph至12.0，继续搅拌30min。待酵母多糖大部分溶解后，加入0.5g一至反应液中，同时将反应温度调节至50℃，反应5小时结束。然后将反应液置于透析膜(截留分子量8000da)中，分别依次在5wt％碳酸氢钠水溶液和去离子水中透析48小时，之后冻干，即得到羧甲基化酵母多糖，记为cmyg-3。
59.(2)将0.5g羧甲基化酵母多糖(cmyg-3)和1g聚氧化乙烯(peo)加入到10ml去离子水中，搅拌过夜，得到澄清的peo/cmyg-3电纺液，随后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，纺丝条件为：正电压范围26.0ev，注射速度为0.5ml/h，接收器转速为150rpm。待电纺液使用完毕，得到基于羧甲基化酵母多糖的静电纺丝薄膜。
60.(3)将步骤(2)中得到的电纺薄膜使用液氮冷冻，并研磨成200目的电纺粉末。之后取1g电纺粉末置于200ml无水叔丁醇中，在30000rpm的条件下匀质均匀，随后将匀浆液倒入圆柱形模具中，在-80℃下冷冻，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h，即得本例中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵。
61.实施例4
62.本例中的用于快速止血的羧甲基化酵母多糖海绵，采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
63.(1)将1g酵母多糖分散于20ml异丙醇中，以3000转/秒的速度搅拌均匀，随后缓慢滴加30wt％的氢氧化钠溶液(3g氢氧化钠溶于10ml去离子水中)，调节ph至12.0，继续搅拌30min。待酵母多糖大部分溶解后，加入0.25g一至反应液中，同时将反应温度调节至50℃，反应5小时结束。然后将反应液置于透析膜(截留分子量8000da)中，分别依次在5wt％碳酸氢钠水溶液和去离子水中透析48小时，之后冻干，即得到羧甲基化酵母多糖，记为cmyg-4。
64.(2)将0.5g羧甲基化酵母多糖(cmyg-4)和1g聚氧化乙烯(peo)加入到10ml去离子水中，搅拌过夜，得到澄清的peo/cmyg-4电纺液，随后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，纺丝条件为：正电压范围26.0ev，注射速度为0.5ml/h，接收器转速为150rpm。待电纺液使用完毕，得到基于羧甲基化酵母多糖的静电纺丝薄膜。
65.(3)将步骤(2)中得到的静电纺丝薄膜使用液氮冷冻，并研磨成200目的电纺粉末。之后取1g电纺粉末置于200ml无水叔丁醇中，在30000rpm的条件下匀质均匀，随后将匀浆液倒入圆柱形模具中，在-80℃下冷冻，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h，即得本例中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵。
66.实施例1、3～4制得的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵的性能与实施例2具有基本相同的性能，因此，本发明采用实施例2中制得的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵进行性能测
试。
67.对比例1
68.本例中的羧甲基化酵母多糖海绵，采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
69.(1)将1g酵母多糖分散于20ml异丙醇中，以3000转/秒的速度搅拌均匀，随后缓慢滴加30wt％的氢氧化钠溶液(3g氢氧化钠溶于10ml去离子水中)，调节ph至12.0，继续搅拌30min。待酵母多糖大部分溶解后，加入0.75g一至反应液中，同时将反应温度调节至50℃，反应5小时结束。然后将反应液置于透析膜(截留分子量8000da)中，分别依次在5wt％碳酸氢钠水溶液和去离子水中透析48小时，之后冻干，即得到羧甲基化酵母多糖：cmyg-2。
70.(2)将1g羧甲基化酵母多糖(cmyg-2)加入到200ml无水叔丁醇中，在30000rpm的条件下匀质均匀，随后将匀浆液倒入圆柱形模具中，在-80℃下冷冻，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h，即得本例中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵。
71.性能测试：
72.(1)外形测试
73.将实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵的外形与对比例1中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵的外形进行对比，具体如图1所示，图1(a)为实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵的外形图；图1(b)为对比例1中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵的外形图，从图1可以看出，本发明实施例2中制得的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵更加松软。
74.(2)微观结构测试
75.分别测试实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵与对比例1中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵的微观结构，具体如图2所示，其中，图2(a)和图2(b)均为实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵的微观形貌图；图2(b)是图2(a)中的表面放大图；图2(c)和图2(d)为对比例1中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵不同位置的微观形貌图。分别对图2中得到的两种海绵的孔隙微结构进行了分析，表明本发明实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵展示出一种纤维状的微纳结构，而对比例1中羧甲基化酵母多糖凝胶海绵展示出常见的多孔结构，本发明实施例2和对比例1所获得的海绵产品的微观形貌差异巨大。
76.(3)粘附性能
77.分别测试实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵与对比例1中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵的粘附性能，具体测试方法为：将实施例2和对比例1中制得的海绵分别置于猪皮表面，并利用万能力学检测仪测定其拉伸强度，该数值指示了海绵的粘附性能，具体测试结果如图3所示。由图3可知，本发明实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵在皮肤表面的粘附能力高于3.42mpa，远大于对比例1中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵的0.68mpa，这说明本发明中制得的气凝胶海绵具有极佳的粘附性能，且具备一定的抗拉伸能力，有助于控制体内的大出血。
78.(4)止血性能
79.分别测试对比例1、实施例2中的海绵和celox
tm
(止血商品celox
tm
的主要成分为羧甲基化壳聚糖)的止血性能，具体测试方法为：使用大鼠肝脏出血模型研究样品的止血性能。分别将100mg的实施例1中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵、100mg的对比例1中的羧甲基化酵母多糖凝胶海绵、和100mg的止血商品celox
tm
分别应用在大鼠肝脏出血位置，然后对止血效果进行了比较，具体测试结果如图4所示，其中：图4(a)、图4(b)、图4(c)分别为采用
实施例2中的气凝胶海绵处理前、处理时和处理后的大鼠肝脏出血模型图；图4(d)为图4(c)伤口处的局部放大图；图4(e)、图4(f)、图4(g)分别为采用对比例1中的海绵处理前、处理时和处理后的大鼠肝脏出血模型图；图4(h)为图4(g)伤口处的局部放大图；图4(i)、图4(j)、图4(k)分别为采用止血商品celox
tm
处理前、处理时和处理后的大鼠肝脏出血模型图；图4(l)为图4(k)伤口处的局部放大图。由图4可知，相对于市售止血商品celox
tm
和对比例1中的海绵，本发明中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵能够迅速止住组织出血，能在伤口处迅速结疤，有助于伤口的愈合。
80.(5)生物相容性能
81.测试实施例2中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵的生物相容性能，具体测试方法为：通过测量红细胞溶解后释放的血红蛋白的吸光度来检测血液相容性。在本实验中，从健康成年人上臂采集抗凝剂新鲜全血，并在采血后2小时内使用。将20ml pbs缓冲液添加到10ml全血中，轻轻混合，然后以5000rpm离心5分钟，然后从离心管底部收集红细胞。将获得的红细胞与两倍体积的pbs缓冲液混合，离心并收集，去除血液中的其他物质，并重复相同的方案5次。然后，通过用新鲜pbs缓冲液稀释制备浓度为5％v/v的红细胞，并将其储存在4℃用于后续实验。将羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵分散在pbs缓冲液中以制备羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵悬浮液。然后将羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵与红细胞悬浮液在1.5ml试管中以1:1v/v的比例轻轻混合，以达到100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和800μg/m的最终浓度，同时设置两组对照组，对照1组采用pbs溶液与红细胞在1.5ml试管中以1:1v/v的比例混合配制；对照2组采用水和红细胞在1.5ml试管中以1:1v/v的比例配制；对照3组采用酵母多糖和红细胞在1.5ml试管中以1:1v/v的比例配制。在25℃下分别培养10分钟、45分钟、90分钟、180分钟、360分钟和720分钟，培养时外形图如图5所示，其中图5(a)、图5(b)和图5(c)分别为培养0min、培养10min和培养12h(即720min)时的外形图；以5000rpm的速度离心样品5分钟。之后，将上清液转移到96孔板上，并使用微孔板读取器在540nm处记录样品的吸光度。
82.溶血率的计算公式为：溶血率(％)＝(as-an)/(ap-an)*100
83.其中，as表示实验样品的吸光度，an是阴性对照品(pbs缓冲液)的吸光度，ap是阳性对照品(去离子水)的吸光度。
84.然后根据不同培养时间计算出的溶血率做图，具体见图6所述，图6中的横坐标为培养时间，图6中的纵坐标为非溶血率数值。从图6中可知，本发明中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵12h的非溶血率均超过95％，即溶血率小于5％，不会引起红细胞的破裂。
85.为了进一步评估经处理12h后的红细胞形态，将离心后保留在试管底部的红细胞取出，并在25℃下用4％甲醛固定2小时，然后，用浓度为50％、60％、70％、80％、90％和99.7％的乙醇分别浸泡处理后的红细胞5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟。样品脱水后，将细胞悬浮液铺在盖玻片上，在25℃干燥过夜并涂金。最后，在扫描电镜下对样品进行了观察，具体测试结果如图7所示，图7(a)为红细胞被pbs处理后的sem图；图7(b)为红细胞被800μg/ml的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵处理后的sem图。根据图5～图7可知，本发明中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵在12h内不会引起血红细胞的破裂，生物相容性好，对机体安全性较佳。
86.(6)抗细菌感染性能
87.测试实施例2中的羧甲基化酵母多糖的抗细菌感染性能，具体测试方法为：将羧甲基化酵母多糖和酵母多糖分别与巨噬细胞共孵育24h，激活巨噬细胞的吞噬性能，再加入金黄葡萄球菌(已被fitc染)，在2h内测试巨噬细胞吞噬细菌的能力，具体测试结果如图8所示，其中，图8(a)为未被处理的巨噬细胞的吞噬细菌能力的荧光图；图8(b)为未被处理的巨噬细胞吞噬细菌能力的明场图；图8(c)为图8(a)和图8(b)的合并图；图8(d)为采用酵母多糖(yg)处理的巨噬细胞吞噬细菌能力的荧光图；图8(e)为采用酵母多糖(yg)处理的巨噬细胞吞噬细菌能力的明场图；图8(f)为图8(d)和图8(e)的合并图；图8(g)为采用cmyg-2处理的巨噬细胞吞噬细菌能力的荧光图；图8(h)为采用cmyg-2处理的巨噬细胞吞噬细菌能力的明场图；图8(i)为图8(h)和图8(g)的合并图。由图8可知，本发明中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵能够激活巨噬细胞的吞噬能力，具有优异的抗细菌感染性能。
88.(7)加速缺损愈合的体外实验
89.伤口的修复主要依靠成纤维细胞的迁移和增殖，伤口在止血后，加速创面的修复至关重要，本发明测试了实施例2中的羧甲基化酵母多糖的加速成纤维细胞的迁移能力，具体测试方法为：将酵母多糖和羧甲基化酵母多糖分别与成纤维细胞共孵育0h、12h和24h，然后测试成纤维细胞的迁移能力，具体测试结果如图9所示，其中，图9(a)、图9(d)和图9(g)分别为成纤维细胞溶液孵育0h、12h和24h的迁移示意图；图9(b)、图9(e)和图9(h)分别为成纤维细胞与酵母多糖共孵育0h、12h和24h的迁移示意图；图9(c)、图9(f)和图9(i)分别为成纤维细胞与羧甲基化酵母多糖共孵育0h、12h和24h的迁移示意图。由图9可知，相对于酵母多糖而言，本发明中的羧甲基化酵母多糖羧甲基化后能够显著的增强成纤维细胞的迁移；进一步表明本发明中的羧甲基化酵母多糖气凝胶海绵具有加速缺损组织修复的潜力。
90.(8)紫外和红外测试
91.分别测试酵母多糖、实施例1～4中的羧甲基化酵母多糖的紫外吸收图谱和红外吸收图谱，其中，酵母多糖和实施例1～4中的羧甲基化酵母多糖的紫外吸收图如图10所示，一、酵母多糖和实施例1～4中的羧甲基化酵母多糖的红外吸收图如图11所示。由图10可知，相对于酵母多糖而言，实施例1～4中的羧甲基化酵母多糖的紫外吸收图明显向短波长方向移动。由图11可知，相对于酵母多糖而言，实施例1～4中的羧甲基化酵母多糖的红外吸收图中的羧基峰明显增强，即由图10和图11可知，本发明中的制备方法成功的对酵母多糖进行了羧甲基化改性。
92.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：

1.一种羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将羧甲基化酵母多糖与高分子材料共混后静电纺丝，然后依次冷冻干燥、粉碎、均质，再冷冻干燥制得所述羧甲基化酵母多糖海绵。2.根据权利要求1所述的羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：所述高分子材料包括聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚己内酯中的至少一种。3.根据权利要求1所述的羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：所述静电纺丝条件为：电压为18.0～26.0ev；注射速度为0.1～0.5ml/h；接收器转速为：100～300rpm。4.根据权利要求1所述的羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥为采用液氮冷冻干燥。5.根据权利要求1所述的羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：所述羧甲基化酵母多糖和高分子材料的质量比为1:(1～4)。6.根据权利要求1～5任一项所述的羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：所述羧甲基化酵母多糖的制备方法为：将酵母多糖与在碱性条件下混合反应，制得羧甲基化酵母多糖。7.根据权利要求6所述的羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：所述和酵母多糖的质量比为(1～4)：1。8.根据权利要求6所述的羧甲基化酵母多糖海绵的制备方法，其特征在于：所述混合反应的温度为45～65℃；所述混合反应的时间为2～8h。9.一种羧甲基化酵母多糖海绵，其特征在于：采用权利要求1～8任一项所述的制备方法制得。10.权利要求9所述的羧甲基化酵母多糖海绵在止血产品、抗感染药物或组织修复产品中的应用。

技术总结

本发明公开了一种羧甲基化酵母多糖海绵及其制备方法和应用，该制备方法包括以下步骤：将羧甲基化酵母多糖与高分子材料共混后静电纺丝，然后依次冷冻干燥、粉碎、均质，再冷冻干燥制得所述羧甲基化酵母多糖海绵。采用本发明中的制备方法制得的羧甲基化酵母多糖海绵，能够加速伤口止血，并能够调节巨噬细胞的吞噬作用，有利用抗感染的。此外，海绵中所采用的羧甲基化酵母多糖能够促进细胞的迁移，加速伤口的愈合。相较于现有技术中的壳聚糖止血剂而言，本发明中的羧甲基化酵母多糖海绵兼具优异的力学性能和吸水性能，同时具有更好的抗感染能力和加速成纤维细胞迁移的能力。染能力和加速成纤维细胞迁移的能力。