第38卷第11期 2019年11月Vol. 38 No. 11 Nov. 2019
ISSN 1006 -7167CN 31 -1707/T
RESEARCH AND EXPLORATION IN LABORATORY
李红梅笃张勤奋笃李茵茵笃张楚英笃张子健b，张以顺*
(中山大学a.生命科学学院；b.华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤防治中心，广州510275)
摘要：在光学显微镜下获得细胞的全视野荧光图像及位置信息，并在培养皿进行 原位细胞透射电镜样品制备、超薄切片及染，最后在透射电镜下获得目标细胞的
433m天线
超微结构信息。釆用该方法成功获得处于细胞分裂M 期细胞的显微结构，既有完 整细胞的荧光图像，又有局部的超微结构的高分辨图像。该方法能够用在较高分 辨率下分析亚细胞结构分布以及特定结构
的动态变化。
关键词：透射电镜；光学显微镜；光电联用中图分类号：Q271；Q64
文献标志码：A
文章编号：1006 -7167(2019)11 -0018 -03
The Application of Correlative Electron Microscopy and
Light Microscopy on the Cells Research
LI Hongmei', ZHANG Qinfen , LI Yinyin , ZHANG Chuying', ZHANG Zijian , ZHANG Yishun
(a. School of Life Sciences ； b. State Key Laboratory of Oncology in South China , Cancer Center,
Sun Yat-sen University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract : Bridging these two modalities , correlative light and electron microscopy ( CLEM ) , can complement each
other very well. The cells were cultured in a grid-labeled dish. The structure of molecules within living cells and localization of interested cells were obtained using optical microscopy. Then in situ cells were prepared for electron microscopy (EM ). Finally , nanometer resolution images of cellular structures in fixed cells was obtained by EM after
ultrathin section and stained. Using this method , the structures of a metaphase cells were successfully obtained , which
contained both fluorescent images of complete information and high-resolution images of cellular structures. This method
can be used for analysis the location of interested substructures in cells and dynamic events in the context of specific cellular structures at high resolution.
Key words : transmission electron microscope (TEM) ； light microscope ； correlative light-electron microscopy
0引言
光学显微镜和电子显微镜都是探索微观生命活动 的重要工具，并提供了丰富的蛋白质定位、动力学以
及
细胞超微结构等信息⑴。自17世纪光学显微镜诞生 以来，显微镜就一直是生物学家从事研究、探寻生命奥
收稿日期=2019-03-05
基金项目：国家自然科学基金资助项目(31570736)
作者筒介：李红梅(1987 -)，女，广东云浮人，硕士，助理实验员，研 究方向：生物物理学细胞生物学。
Tel. : 138********; E-mail : lihongmei@ mail. sysu. edu. cn
秘必不可少的利器"切。透射电子显微镜的特点是分 辨率高，对细胞的超微结构观察具有极大的优势，但缺 点是没法观察活细胞、景深和观察范围小3」。相反， 光学显微镜具有景深大、观察范围广，能进行活细胞观 察等特点「呵，结合免疫荧光技术在以蛋白、脂质或者 离子作为靶标来探索细胞生理活动，其应用几乎渗透 到所有的细胞和分子生物学中，在细胞结构或组分的
定位与半定量研究、活细胞在时间轴上的变化、脂膜的 流动性分析、药物筛选等方面研究有着重要贡献卩"；
激光共聚焦显微镜和超高分辨显微镜还可以获得三维 的图像〔他，可以更好地了解细胞活动过程。跟其他
仪器一样，光学显微镜也有其技术缺陷，与透射电镜相
第11期李红梅，等：透射电镜和光镜联合应用于细胞观察19
比，最突出的一点是其分辨率不够高，普通光学显微镜
的极限分辨率是200nm，几经发展，目前超高分辨荧
光显微镜的分辨率提高了一个数量级，达到10rnn左
右[M1]o因此，光学显微镜和电子显微镜的联用(光电
联用)能很好地弥补各自的缺点，可在原位获得更多
更全面、更精细和高分辨的细胞信息，近年来受到了广
泛的关注，尤其是冷冻光电联用快速发展，也出现了一
些尚未完全成熟且价格昂贵的光电联用配套设备。总
体而言，光电联用技术对生命科学相关学科非常重要,
但该技术还在不断发展中。
本文尝试使用大多数生命科学相关实验室能得到
的光学显微镜和最常用的生物电镜设备，进行光电联
用，对处于分裂中期(M期)细胞进行观察。
氧气过滤器
1材料与方法
1.1细胞培养及处理
采用刻有网格标记的培养皿|i-Slide CorrSight Live(ibidi，德国)培养细胞。培养皿共6个孔，每个孔中有横向编号A-Z-a-e共31个数字，纵向编号从1~ 30，共900个小格，每个小格长度为100jim，小格中可容纳多个细胞。使用加有血清的普通细胞培养基(Gibico)。细胞采用已有稳定表达内质网驻留绿荧光蛋白ER-EGFP和融合红荧光的组蛋白H2B-mCherry的HeLa细胞。通过胸腺囉呢核昔双阻断法配合R03306阻滞释放获得分裂中期(M期)细胞。1.2光学显微镜观察
首先在倒置荧光显微镜(1X73,OLYMPUS)的透射光明场下观察，物镜为10xPH o初步观察细胞分布情况后，再在配有数值，孔径为100x/1.49的油浸透镜和固体激光器(488,561,647nm)的超分辨显微镜(Nikon)上观察，用ORCA-Flash4.0(HAMAMATSU)数码相机采集荧光图像(见图1)，并且记录目标细胞所处的网格位置。再根据在超分辨显微镜观察记录的信息返回倒置显微镜，获取更加详细的定位信息，包括周围细胞形态、数目分布等环境信息。
1.3透射电镜样品制备及观察
将上述带有目标细胞的培养皿，连同上面的培养细胞进行原位样品制备，用2.5%戊二醛2%多聚甲醛混合固定液4七固定过夜后，吸弃废液，用PBS(0.1 mol/L,pH7.4)洗3次；1%的四氧化娥(0s04)常温下固定1h；回收0s04废液；再次用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.1mol/L,pH7.4)洗涤3次，每次10min；乙醇溶液梯度脱水；浓度从低到高的SPI-812环氧树脂进行渗透后，将事先用0.5mL离心管盛装的树脂聚合成棒的粗的一头削平，并轻轻倒扣在培养皿，接触培养皿中的包埋剂(尽量避免气泡产生)。由于其直径和所使用的培养皿孔的差不多，树脂棒一般在皿口位
图1荧光显微镜和透射电子显微镜在细胞观察中
联用的实验过程
置，不会接触细胞。放置于烘箱60t聚合24h。
聚合好的树脂通过先加热后放进液氮中冷却的方法，将原来用于支持细胞的培养皿材料从聚合好的样品块剥离，借助网格标记锁定目标细胞，用削块机修去多余的部位。在超薄切片机(Leica EM UC6)用钻石刀(Diatome)切成约100nm厚的超薄切片。经2%的醋酸双氧铀和3%柠檬酸铅双染。最后在透射电镜(JEM-1400)下观察。整个过程的流程图见图1。
2结果和讨论
2.1光学显微镜观察结果
首先在倒置荧光显微镜的明场下观察，可看到所培养的细胞少部分呈分散分布，大部分成团单层分布，一个小格可有多个细胞(图2(a))。虽然在同一培养皿中加入药物处理细胞，但并不是所有的细胞都被阻断在M期，有的细胞仍处在分裂间期。荧光显微镜检查发现,M期细胞所占比例并不高。分裂间期的细胞有明显的细胞核，部分内质网紧紧围绕在细胞核周围(图2(b))。进入M期的细胞，细胞核内的遗传物质聚集形成多个小团，内质网绕着成团的染体存在
图2光学显微镜下的细胞分布、形态结构
(a)倒置显微镜下的细胞分布；(b)图(a)局部放大图；(c)左侧细胞为分裂间期细胞，右侧为M期细胞。可以看到M期细胞中染成红的组蛋白成团块状分布在细胞中，周围有绿标记的内质网分布。绿EGFP标记内质网；红mCherry
标记组蛋白
20第38卷
（图2（b））。
2.2透射电镜观察结果
透射电镜下，同样可以观察到两种细胞形态同时存在。处于分裂间期的细胞（见图3（a）,3（b））和处于细胞分裂M期的细胞（见图3（c）,3（d））。电镜中观察可发现两种状态细胞的内质网长度具有明显不同。分裂间期细胞的内质网相对短，且有的地方内质网成锁链状，也没有形成片层状结构环绕细胞核。而M期细胞的内质网相对较长，成片层状结构环绕着细胞核物质分布；此外，细胞内的线粒体、溶酶体等结构也可以在电镜图像中观察到。有些线粒体发生空泡化现象，这些可能与实验中使用药物或培养时间过长有关。
图3电镜下HeLa细胞被阻断在分裂中期和在分裂间期的细胞形态
（a）分裂间期细胞。（b）图（a）细胞的局部放大，可见线粒体、内质网和溶酶体等。（c）M期细胞；（d）图（c）局部放大。N：细胞核，黑箭头：内质网，白箭头：溶酶体伍角星号：染体,M：线粒体
2.3光电联用观察结果
为了把光学显微镜和电镜观察结果对应起来，实验中进行了光电联用的尝试。首先借助荧光标记，在488nm和561nm波长的激发光下可以看到红荧光蛋白标记的染体/染质和绿荧光蛋白标记的内质网，通过超高分辨显微镜到被阻滞在M期的细胞，采用ORCA-Flash4.0数码相机采集荧光图像（图4（a）），同时记下该细胞所在位置（D孔21CD小格间）。从荧光图像可以看到目标细胞的染体和包绕在其周围的内质网。转换到在倒置显微镜，在D孔21CD间的位置到目标细胞，观察细胞所处环境（图4（b）），该处周围有3团细胞，目标细胞处于其中一个细胞团的边缘，目标细胞相邻的一团细胞有个较大的梭形细胞，其形态特殊，可作为突出标志帮助后续定位。而后经过原位固定、脱水和包埋聚合。切片前，首先根据培养皿标记，确定靶标细胞所在部位，定位后对周围进行修块处理，最后进行超薄切片，染后透射电子显微镜下观察。电镜下已不可能有培养皿的网格标记，此时倒置荧光显微镜下观察到的细胞的形态及其周围细胞的形态、分布可作为依据，帮助到对应的目标细胞。本实验倒置荧光显微镜下看到的那个大梭形细胞就可用来作为辅助靶标，帮助确定最后目标细胞（图4（c））o实验中该目标细胞的结果显示内质网长长地包绕在染体外（图4（d）），这些结果跟荧光显微镜观察的结果一致。同时，电镜下还观察到目标细胞具有呈典型的M期细胞特征，细胞核内染体结构明显，核周没有明显的核膜结构。此外还可看到细胞内的线粒体等亚细胞结构。
图4光电联用实验结果
（a）超高分辨显微镜获得的M期细胞，绿包：内质网；红：染包体。（b）经戊二醛固定后在倒置显微镜获得的图像，目标细胞在21排的C 和D列间（箭头所示），在其右侧（21D）有一个圆的细胞和一牛梭形细胞（三角形箭头）。（O）透射电镜较低倍数的图像。图中有午明显的梭形细胞（三角形箭头），下方有3个细胞，根据（b）图可以确定箭头所示的目标细胞；（d）目标细胞的常规电镜图像
3结语
实验结果表明，利用有标记的细胞培养皿、常规化学固定、常温常规光学显微镜和电镜等耗材和设备，可以进行光电联用的研究并成功获得结果。这对大多数农林、生命科学、医学等相关学科的普通电镜使用来说，一方面可以帮助获得一些重要的结果；另一方面，本实验使用的方法具有方便、成本低、易操作等特点，可以一定程度上为缺乏冷冻电镜和冷冻光电联用设备实验室提供解决很多科研问题的新方法。
（下转第65页
）
第11期荣臻，等：低湍流度静声低速风洞及气动设计65 壁内消声处理以及减振处理。隔声处理主要通过环绕实验段的消声室，实现对外隔声、对内吸声。风源和风洞主体之间用管道消声器来衰减风机驱动装置的强噪声，风源选用低噪声风机。此外，风洞设计加工需考虑流道壁面的光顺性，以减小风管再生气动噪声，采取一系列减振措施用于防止风洞管壁振动产生辐射噪声。
经测试，常用风速35~50m/s下，实验大厅靠各监测点噪声均小于60dB；在整个运行风速范围内，大厂进出气口外噪声均小于55dB o
5结语
低湍流度静声风洞已通过验收并正式投入使用，其主要性能参数指标优于国军标要求。该风洞不仅满足测力、测压、流态演示等教学需要，还可开展无人机气动、非定常流动控制以及仿生气动研究等科学研究工作，将提高我校空气动力学基础应用研究的水平。
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