1生物芯片是将大量生物分子按预先设计的排列固定于一种载体表面，利用生物分子的特异性亲和反应，来分析各种生物分子存在的量的一种技术。 广义：生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子等进行准确、快速、高通量检测。 2生物芯片与电子芯片
相同点: “小”、“大”、“数字”
不同点: 材料、输入信号、使用寿命
3生物芯片的特点：高通量、微型化、自动化
4如何理解生物芯片
生物芯片是生物材料的集成
生物芯片是一个载体平台
生物芯片是一个棋盘
5铝酸钙粉生物芯片技术研究存在的问题
重复性（稳定性） 灵敏度 标准化 设备及软件 操作过程
6生物芯片技术产业化存在的问题
用于临床必须保证高度的准确性和安全性。
获得医疗卫生部门认证的芯片公司非常少。石墨烯供暖设备
7生物芯片技术主要包括四个基本技术环节：芯片制备 样品制备 生物分子反应 信号的检测与分析
8生物芯片的制备步骤有哪些？分别有什么目的？
基片处理
目的：要使得要使得基片表面富含活性基团，这种活性基团具有吸附能力和固定能力，能很好的连接生物分子。 方法：表面修饰 表面涂敷
目的：将生物分子放到芯片表面指定的位置。 方法：接触式点样 非接触式点样 点样元件
固定
定义：处理好的基片结合各种生物分子的过程。目的：加强生物分子与基片表面的结合方法：室温放置、紫外交联、烘烤
封闭
定义：固定完以后，用一些试剂将基片表面没有固定生物分子的活性基团反应掉，这一过程称为封闭。目的：降低芯片在使用过程中表面的非特异性结合，提高芯片的灵敏度。封闭试剂：指进行封闭所采用的试剂。常用的封闭试剂：硼氢化纳、三乙醇胺、BSA
9基因芯片是指将许多特定的DNA序列排列固定于固相支持物表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行和高效的检测和分析。 分类：以载体材料分：玻璃芯片，膜芯片、硅芯片 以制作方法分：原位合成芯片，直接点
样法芯片 以载体上的基因种类区分：寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片 以芯片的功能分：基因表达谱芯片，测序芯片
原理：碱基的互补配对
四大步骤：基因芯片的制备 待测样品制备 杂交 杂交结果的检测和分析 芯片的制备：设计、预处理、制备技术、完善程序。
待测样品制备 ：根据样品来源、基因含量、检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须扩增
核酸杂交
两条核酸链的杂交效率受诸多因素影响： 序列影响因素
非序列影响因素
互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。
杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、检测基因的二级结构的影响
10载体概念：用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为生物芯片的载体。
11如何选择载体？（对制作生物芯片的载体有什么要求？）
载体表面必须具有可进行化学反应的活性基团，以便于生物分子进行偶联。 使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量 载体应当是惰性的和有足够的稳定性 载体具有良好的生物兼容性，以利于制作不同种类的芯片。
载体类型：玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜等
膜：优点：有孔性三维结构，与核酸亲和力强，杂交技术成熟，通常无需另外包被。缺点：膜的表面性质不是很均一；单位面积上点样密度低，需要更多的样本量；背景较高；容易卷曲等。所以限制了膜的应用范围。
玻璃：持久的载体，耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，使杂交体积降低到最小；疏水表面克服了样点容易扩散的缺点，提高了样点的密度；荧光信号低，不会造成很强的背景干扰；
硅:除了具有玻片的性质外，还有良好的导热性。缺点：不透明，不利于光学检测；具有比较强的表面非特异性吸附；不容易进行表面修饰。
12寡核苷酸芯片是把寡核苷酸固定在玻片上，与荧光标记的待检序列在一定条件下杂交，经洗涤后扫描获得检测信息。
步骤：
使基质材料羟基化，并用光敏保护基团保护。 选用适当的掩模使光选择性地通过。 被光照的部位羟基去保护，与单体分子发生聚合反应。 更换掩模、单体种类和反应次序进行重复工作。
14合成后微点样原理
利用手工或自动点样装置将预先合成和纯化的寡核苷酸点在经特殊处理的载体上即可。
包括接触式与非接触式两种，主要用于中低密度芯片制备
15判断一台点样机器是否优秀的指标：点样精度；点样速度；点样密度；点样强度；清洗系统、污染控制；温度、湿度控制；自动化程度等。
16样方式及点样针
接触式点样 实心针 裂缝针 圈套针
非接触式点样
通过足够大的压力快速挤压点样针内的停滞液体而形成一液滴，并能克服液体在喷嘴内的表面张力，最终从喷嘴喷出
17环的制作材料与环的内表面特性是决定从样品中所取液体体积大小的两个最主要的因素
18点样的后期处理
目的：为了使探针能与载体表面牢固结合，同时，避免在杂交过程中非特异性的吸附对实验结果（特别是背景）造成影响。
芯片点样后期处理的步骤：
再水合：反应充分 样点均一
紫外交联：增强离子键
洗涤剂洗涤：洗去游离样品
双蒸水洗涤---室温晾干
封闭液封闭：去除基片表面游离的活性基团
双蒸水洗涤---室温晾干。
19寡核苷酸芯片制备的质量控制
样品的处理 寡核苷酸分子的设计：较长的序列有较高的灵敏度，但是特异性识别能力差；较短的序列特异性好，但是灵敏度低 生物识别的控制 数据的获得与分析 环境控制
20个体优化问题：某一个阵列上的生物识别的特异性和灵敏度如何保持和控制 全局优化
问题：如何让绝大多数的点都处于各自最佳的生物识别环境
21cDNA微阵列芯片是由固定于基质材料上的cDNA片段组成的微阵列，待测样品标记后与芯片上的探针分子杂交，通过荧光强度的检测对杂交结果进行分析。
22cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合
23cDNA基因文库构建的步骤
细胞总RNA的提取和mRNA的分离 黄粉虫筛选机第一条cDNA合成 双链cDNA合成 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖
24细胞总RNA的提取和mRNA的分离 原理：利用真核生物的mRNA的3‘端都有polyA，用polyT纤维素亲和层析纯化mRNA 方法：两步法：Total RNA-----mRNA 一步法：mRNA
25避免RNA反应容器酶污染
塑料制品：尽可能使用无菌、一次性塑料制品。 玻璃和金属制品： 使用前必须于180℃干
烤8小时或250℃烘烤3小时以上。 电泳槽：用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1%DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。 移液器： 一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，基本达到要求。 溶液：用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。 研究人员： RNA酶广泛存在于人的皮肤上，最主要的潜在污染源是研究人员的手
26合成cDNA第一链
Oligo（dT）引导cDNA合成法。由12-20个T组成的人工合成寡核苷酸片段作为引物，引导反转录酶以mRNA为模板合成与之互补的cDNA。优点：cDNA文库比较“纯”
缺点：通常都缺乏模板mRNA5’端的重要序列信息。
随机引物的引导合成。一条模板mRNA上可能会同时杂交上多个引物序列，并在模板多处位点上同时引发cDNA反转录合成。优点：能有效地反映出表达mRNA全长的序列信息。缺点： cDNA文库不“纯”
27合成双链的cDNA
cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。方法：置换合成法 自身引导合成法：获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链
28cDNA克隆
将合成出的双链cDNA克隆在载体上，并导入相应宿主细胞中，是cDNA文库构建的最后一步。
29cDNA文库构建的效率低 造成这种低效率的主要原因？如何提高cDNA文库构建的效率？
目前构建cDNA文库的的标准方案里，从mRNA模板出发到最后转化成双链cDNA片段，需要经过多步的体外酶学反应。 由于无法做到每步酶学反应结束后都纯化反应产物，故只能采取折中的策略，将所有的酶学反应都放在一个经优化的基础缓冲体系中进行。这种经过优化的反应条件，并不是各种酶的最佳活性条件。因此，在cDNA文库构建过程中，许多酶学反应并未能发挥出各种酶的最佳催化活性，其反应效率自然不是最高的。
提高效率的方法：
在反转录引物的5‘端预先设计一个稀有的酶切位点，并通过5‘端偶联在惰性材料的固相介质（磁珠）上，用这种固相化的引物启动cDNA合成的各步反应。 在双链cDNA合成完毕以后，可用识别引物5’短酶切位点的稀有限制性酶进行酶切，将合成的cDNA与固相介质分离
30核酸芯片应用—表达谱基因芯片
表达谱基因芯片：用来检测样本中RNA/mRNA，即基因表达（转录水平）的研究芯片。 表达谱研究的方式：基因表达丰度的绝对检测 基因表达发生变化的相对检测
31cDNA表达谱芯片的实验过程
总RNA抽提、mRNA分离。RNA质量控制分析。cDNA探针的分析 芯片杂交
1、总RNA抽提（TRIzol法）
准备组织或细胞+Trizol +1/5体积的氯仿，混匀、静置、离心。 导针取上清+异丙醇进行沉淀、离心。 加乙醇洗涤沉淀。 晾干沉淀，+RNase-free的水溶解沉淀。 取1-2ul稀释，测
定OD值计算浓度。-80C冰箱保存待用。 mRNA的分离使用QIAGEN Oligotex mRNA 纯化Kit
弹簧绳
2、RNA的质量控制分析
琼脂糖凝胶电泳
配制TAE电泳缓冲液。
制备1%的琼脂糖凝胶。
准备样品、上样电泳。
拍照，保存图像。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议