一氧化氮发现的故事！ |
1980年美国药理学家Furchgott以其精妙的实验在Nature上发表论文，指出乙酰胆碱（ACh）的舒血管作用依赖血管内皮释放的某种可扩散物质。随后他们又发现缓激（BK）等多种扩血管物质的作用也是通过类似的机理，并将该物质命名为（血管）内皮舒张因子（EDRF）。1986年他们和美、英的多个实验室相继证实EDRF就是一氧化氮（nitric oxide，NO），从而首次发现气体分子可在生物体内发挥信号传递作用，开辟了医学研究的一个全新领域。1992年NO被Science评选为“年度分子（molecule of the year）”，同期的Science以醒目的“Just say NO”为封面、以“NO News is Good News”为题发表专论，高度评价了NO的发现及其生物学意义。Furchgott在1996年继获著名的Albert Lasker医学研究奖后不久，又与在此领域也作出重要贡献的另两位美国药理学家同获1998年诺贝尔生理学或医学奖。 NO是什么？ 对硝基化合物的应用和认识 EDRF的发现 NO是EDRF的确证健康 NO发现给我们的启示 NO是什么？ 十年前人们对此问题的答案是：NO是一种大气污染物，是吸烟、汽车尾气及垃圾燃烧等释放出的有害气体，可破坏臭氧层导致酸雨、甚至致癌，它还曾作为化学毒剂应用于战争。我们现在知道，NO学生枕既是气体，也是一个自由基（free radical），是机体内一种作用广泛而性质独特的信号分子（signaling molecule）：在神经细胞间的信息交流与传递、血压恒定的维持、免疫系统的宿主防御反应中等方面，都起着十分重要的作用，并参与机体多种疾病的发生和发展过程。 NO是由细胞内的左型-精氨酸（L-Arg）经一氧化氮合酶（NOS）作用而生成。NO在不同的器官、不同生理或病理状态下可发挥或利或害的双重作用，被称作“双刃剑（double-sided sword）”：在生理状态下，L-Ang经细胞内原生型NOS（cNOS）途径生成低浓度NO，发挥信号传递、维持血管张力等生理作用；在病理条件下则通过激活诱生型NOS（iNOS）持续产生大量NO，由此途径生成的NO往往表现为细胞（cytotoxic）作用。既往所知的生物信息分子，通常为蛋白及多肽等大分子或结构复杂的单胺类物质，而NO仅由氮和氧两个原子组成，其分子量小于100——它是迄今发现的体内最小、最轻、最简单的信息传递分子。此外，在作用方式上，传统的生物信号分子都是与细胞膜或细胞内特异受体结合，经细胞内特定信号转导途径引起细胞功能变化，而NO在体内则是通过广泛的化学/自由基反应而发挥生物效应。 那么，何以如此简单而又广泛分布的NO长期未被发现？其关键原因之一是NO生物半衰期很短（约叉车称重3-5秒），极易和体内其他自由基等反应而被清除；再者NO这一无机分子也许太简单，而被那些似乎总在寻更为复杂的生物分子的科学家忽略了。此外，NO性质独特，其作用方式不同于经典生物活性物质或神经递质，如神经系统中NO既不储存于末梢突触囊泡中，也不以胞吐方式释放，而是靠其脂溶性在细胞内、细胞间弋，通过化学/自由基反应发挥作用并灭活。但NO的发现绝非偶然，其客观上被应用和研究的历史实际上已长达一个多世纪。 对硝基化合物的应用和认识 早在19世纪70年代，人们就发现有机硝酸酯对缺血性心脏病有良好的作用，但当时并不了解其作用机理。19世纪末，在诺贝尔以研制TNT闻名和发迹的同时，人们惊奇地发现，用于缺血性心脏病的（GTN）竟是TNT的主要活性成份，人们对此困惑不已。 直到本世纪60年代，科学家发现亚硝胺在体内具有致癌作用，继而开始研究生物体内亚硝酸盐（NO2-）的代谢。发现机体在正常情况下就可产生和排泄NO2-和硝酸盐（NO3-nmda受体拮抗剂），其中巨噬细胞是体内NO2-来源之一。在此期间，多种硝基类扩血管药物更广泛应用于临床，并成为急性心肌缺血的首选急救药。值得一提的是，早在上世纪末，德国学者Griess就研究和发表NO2-的检测方法，但当时对其与NO的关系并不了解。由于NO2-是NO在水溶液中氧化代谢的终产物而相对稳定，改良的Griess法至今仍是目前实验室间接检测NO含量最简单、最常用的方法之一。 EDRF的发现 在药理学实验室里，另有一些科学家，对于看似与NO并无直接关联的乙酰胆碱（ACh）等血管活性物质的作用机理颇感兴趣。1953年Furchgott博士发表了首篇ACh和组胺致兔离体血管条收缩的论文。这与当时公认的给整体动物静注ACh或组胺引起血管舒张效应的观点恰恰相反。但他当时坚持自己的实验重复性良好，且观察无误。并在随后（1955年）发表的“血管平滑肌药理学”综述中提出假设，认为犹如肾上腺素能有α和两种受体一样，血管平滑肌上也同时含有运动性和抑制性两种胆碱能受体——现在看来这一结论是错误的，然而在当时这一观点一直被当作权威而认可。其间在1962年，有一个叫Jellife的医生曾发现并报道在血清素预收缩的血管环上，低浓度ACh通常是导致其舒张，仅当很高浓度ACh（＞10-4mol/L）时才使血管收缩。遗憾的是这篇文章当时并未引起人们的重视。直到70年代中后期，虽已有更多实验室发现并报道ACh对离体血管的舒张作用，但一方面由于对“权威”的崇拜，另一方面由于对此问题报告结果尚不完全一致，且当时已确，ACh对非血管平滑肌的作用是收缩效应，致使在ACh对离体动脉血管作用的问题上虽存在着明显的矛盾[后来Furchgott称此为“ACh悖论（the paradox of ACh）”]，但在长达20年时间里却一直无人深究这一问题并对Furchgott的理论提出质疑。直到1978年，还是在Furchgott的实验室，一次偶然的事件才使这一矛盾得以澄清。 其起因是该实验室一名叫David的技术员的粗心。他未按Furchgott为他写好的实验步骤操作，结果发现拟用于预收缩血管的胆碱能M受体激动剂carbachol（CCh，ACh钢领圈类似物）并不使兔主动脉环收缩，相反却总是使其舒张。他到办公室到Furchgott抱怨说：“一定是哪儿出了问题”。Furchgott来到实验室仔细检查了实验，他首先注意到David没有按他写明的加药顺序进行实验，即在还未洗掉浴槽中去甲肾上腺素（NE）时就加入了CCh，这时血管环正处于收缩状态。同时他发现CCh确实总是引起收缩状态的血管环舒张。于是他们一起检查其原因：是CCh被NE污染了？可重新配制的CCh仍使动脉环舒张；再用新配的ACh替代CCh加入浴槽，仍是舒张反应。此时Furchgott注意到，他以往实验用的是螺旋血管条标本，而David采用的则是更易制备的主动脉环。于是他们开始比较这两种标本制备是否会造成血管反应性的差异。他们首先把对ACh呈舒张反应的血管环取出浴槽、剪成血管条，再挂入浴槽后加入ACh。此时Furchgott注意到标本制备时干净利落，一次就顺利挂入浴槽的血管条往往都对ACh呈明显舒张反应，而对ACh无舒张或舒张反应弱的那些标本多是被反复操作使内膜面受摩擦的血管条——这是他们得到的第一个线索：即无意的内膜摩擦可能导致血管失去对ACh的舒张反应。 继之他们又仔细检查了螺旋血管条的制备方法（这是Furchgott实验室25年来一直使用的常规血管标本制备法）。Furchgott此时又惊奇地发现，他们以“常规方法”制备血管条过程中，血管内膜面恰好一直搭在手指尖上，且为防止血管条卷曲，他们又通常是把剪下的血管条内膜面朝下平铺于湿润的滤纸上，再切成长短适宜的血管条。他们立即改进上述方法，小心保持不触及内膜面，结果发现，这样制备的血管条对ACh则呈良好的舒张反应。他们把这一发现立即在当年7月一次学术讨论会上作了报告，摘要发表于《血管（Blood Vessels）（1979）上。这是首篇打破“ACh悖论”、接近于发现EDRF的正式学术报告。 然而为什么动脉血管内膜面摩擦会导致其丧失对ACh的舒张反应呢？虽然内皮细胞被列入怀疑对象，但当时Furchgott首先想到的是机械摩擦造成血管壁细胞损伤，损伤的细胞释放某种酶使血管平滑肌上的M样“舒张”受体失活。为此，他们又走了一些弯路。其间一位组织学家的工作险些葬送了他们的发现：Furchgott将呈良好舒张反应和摩擦后不舒张的两种血管环标本送到另一实验室做组织学检查，经切片、固定、染后送回来的片子上两种标本都不含内皮细胞，也就是说，这一组织学结果已排除了内皮细胞在舒张反应中的必要。庆幸的是，半年后他的实验室来了一位新技术员，他改进了组织染方法，而终于发现内皮细胞的有无是血管舒张与否的关键。1979年春，第二篇更接近EDRF的论文摘要投寄至美国药理与实验学学会年会上并在当年报告，该论文已明确提出血管内皮细胞与血管反应性有关。 接下来的问题是：为什么刺激内皮细胞可引起血管平滑肌舒张？这次似乎是单刀直入，他们首先想到的是血管内皮细胞受刺激后释放某种物质扩散至平滑肌并导致其收缩。Furchgott象是受到某种特殊的启示，他回忆道：那天早晨我刚醒来，一个漂亮的实验设计突然闯入我的脑海。于是我来到实验室，立即按这一方案进行了实验——得到的结果便是本文开始提到的1980年发表于Nature上的那篇著名论文“内皮细胞是ACh诱发动脉平滑肌舒张的必需因素”。 该文仅用了离体血管条灌流和光镜组织学检查两种非常简单的实验技术，其令人叹服之处在于血管条实验的设计。实验分四步观察不同情况下兔主动脉对ACh的反应： （1）正常血管及与内膜摩擦处理后的比较； （2）正常血管环与胶原酶处理（化学损伤内皮）后相比较； （3）a、横血管条（与管壁平滑肌走向一致）并去内皮，b、纵血管条（与平滑肌垂直）含内皮，c、a与b并列挂在同一个浴槽，内膜面相近且相对，d、c实验完后立即移除b； （4）正常血管环，浴槽内通O2与缺O2（通入N2）的比较。其中第（3）步的精彩和第（4）步的出人意料使人印象颇深。（3）中所用方法即是后来被称之为sandwich preparation的“三明治”血管灌流模型。（4）中所得实验结果直到数年后明确内皮细胞释放的就是NO、且NO生成需O2时，人们才由衷地叹服Furchgott当年实验的巧妙，真像“鬼使神差”！ 值得一提的是，在Nature上的这篇文章当时还没有明确提出EDRF，直到1982年他们发表于《美国国家科学院通报》（PNAS）上关于BK内皮依赖性舒血管作用的论文中，才正式提出EDRF这一名词。这其间还有一个小插曲：此文投稿前他们曾一起讨论如何命名这一舒血管介质，其中endothelium-derived relaxing三字很快被确定，只是最后一字是用substance、factor还是material未决。最后他的学生一致认为选factor为妙，因relaxing factor（舒张因子）的缩写RF恰好与老板Robert F. Furchgott名缩写RF巧合，以此来纪念Furchgott及他领导的实验室。Furchgott欣然接受了这一荣誉。 NO是EDRF的确证 EDRF很快引起了世界上众多心血管生理及药理学家的兴趣，其作用被多个实验室重复并验证。那么该EDRF究竟为何物？Furchgott最初推测该介质应是一种较稳定的物质，可能是脂氧化酶（lipoxygenase）作用于不饱和脂肪酸的产物。然而对此物质的确定似乎比他们想象的要复杂，研究迟迟未取得明显进展。与此同时，英国Wellcome研究中心Moncada研究小组发现EDRF并不稳定，认为其可能是自由基或前列腺素家族类小分子；美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）药理系Ignarro实验室则发现EDRF与硝基类扩血管物质作用机理相似，即都是通过升高血管平滑肌细胞内cGMP途径，且两者在药理学特性上有诸多相似之处。而在Texas大学医学院，多年来一直独立从事扩血管作用研究的药理学家Murad，实际上早在1977年就发现硝基酯类药物及外源性NO均可使cGMP增高，他们甚至提出硝基酯类药物可能是通过形成NO或某种活性物质升高细胞内cGMP，进而使血管扩张和血小板抑制。至此，众多研究汇聚到一个焦点——硝基类活性物质。 1986年中，Furchgott和Ignarro几乎同时分别提出NO可能与EDRF为同一种物质或其组分之一。1987年Moncada又以巧妙的实验设计得出令人信服的证据，在Nature上发表了“NO释放可解释EDRF的生物活性”论文。他们将培养的血管内皮细胞铺附于微载体（microcarrier）上，然后装柱并以Krebs液灌柱洗脱，流出液以不同时间间隔瀑布式淋浴去内皮细胞的兔胸主动脉条以检测EFRF的生物活性，同时用化学发光法（chemiluminescence）检测流出液NO含量，并将流出液与GTN的药理作用定量对比。他们发现，由BK诱导的血管内皮释放的EDRF，不仅与NO在生物活性、半衰期等生物学特性上完全一致，亦可被同样的药物阻断剂或激动剂所抑制或增强。 至此，NO镀锌光亮剂脱颖而出，一跃成为生物医学界关注的焦点，人们形容这一“不起眼”的小分子为“灰姑娘”。而在此领域的研究更是突飞猛进，科学家很快相继证实NO即为诸多硝基类扩血管药物作用的终效应分子，L-Arg是生物体内NO生成的前体，并纯化了NOS。1991年美国Johns Hopkins大学神经药理学家Bredt等进一步在脑组织中克隆出NOS，从而全面揭示了生物体内L-Arg-NOS-NO系统。 NO发现给我们的启示 其一，科研思路（idea）是科学研究的首要因素。发现EDRF的实验并未借任何“现代”仪器，使用的仅是常规血管条灌流和普通光镜组织学检查方法。而其实验设计匠心独到，尤其是“三明治”血管灌流实验让人叫绝。无独有偶，这与70年前（1920）采用离体心脏灌流实验发现“迷走递质”（ACh）而获诺贝尔奖的奥地利生理学家Loewi的实验可谓有异曲同工之妙。同样，Moncada等以培养的血管内皮细胞装柱淋浴灌流去内皮血管条的生物检测法亦相当精彩，令人难忘。这些都可谓“简单实验，优秀设计（easyexperiments, excellent design）”的典范。这些大师的工作再次告诉我们，在研究方法的选择上不必一味追求高精的仪器，而以能使结论明确、说明问题为原则。手段单纯、设计巧妙有时可使结论更明确。关键在思路！ 其二，尊重实验结果，让实验说话。Furchgott是一位典型的坚持“让实验说话”的科学家。基于实验，他曾由于对难以预料的实验条件的认识或控制不当而作出错误的结论，但也正由于他对实验的尊重，使他认识到自己的错误，最终得以发现EDRF；前文中提到的Jellife不畏权威的观点，不附和当时大多数人的结果，如实将自己的实验结果报告，而使他原本并不复杂的工作，在二十多年后的今天仍被人们反复引用；还有那个“粗心的”技术员David如实地将实验结果报告，使Furchgott有机会发现EDRF……。 其三，活跃、竞争的学术思想是独创精神不可缺少的土壤。Furchgott1980年发现EDRF，启发了药理学家对血管内皮细胞功能多样性的认识。时隔不到两年，Vanhoutte实验室又提出了内皮收缩因子（EDCF）的存在，还有人提出内皮超极化因子（EDHF）。1986年美、英的多个实验室先后证实NO即为EDRF；1988年日本学者Yanagisawa又发现了内皮素（endothelin，ET）。血管内皮研究领域一时新星争相辉映，在不到十年的时间里，在发现EDRF思路的启发下，内皮细胞的研究取得了令人震惊的进展，并出现了“内皮生物学”这一新的学科，《内皮生物学杂志》也应运而生，几十种NO工具药被研制开发，“伟哥（viagra）”等基于NO机理研制的药物迅速应用于临床。如果没有创新、活跃的学术思想和竞争的学术环境，在如此短的时间内取得这样的研究进展是难以想象的。 因此，我们不能只抱怨缺乏科研资金、缺乏实验条件，这对时至今日的科研工作固然相当重要。但更重要、实际上也是我们更缺乏的是科研思路，是创新的意识和思维。我们目前在硬件上与国外相比确有差距，但切不可因此认为我们与科学发现相距遥远。实际上，在科研中最重要的思路上，我们与国外科学家应是站在同一起跑线上。我们一定要意识到学术思想才是第一位的！有好的素质、好的思路，在我们现有实验条件下同样可能做出优秀的工作。Furchgott发现EDRF和NO的故事，不是又一次给了我们这样的启示吗？ |
本文发布于:2024-09-20 17:25:59，感谢您对本站的认可！
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