第32卷第4期光散射学报Vol.32No.4 2020年12月THE JOURNAL OF LIGHT SCATTERING Dec.2020
文章编号:1004-5929(2020)04-0312-08
陈献‘陈欢^陈周卸‘李杨丹婷1*，沈立F2*
"1宁波大学医学院，浙江宁波315000!宁波大学附属人民医院，浙江宁波315040)
摘要：铜绿假单胞菌可导致临床慢性感染，是烧伤、泌尿道感染、囊性纤维化等感染的重要致病菌&铜绿菌素是铜绿假单胞菌产生的次生代谢产物，可导致感染患者细胞死亡，与高死亡率息息相关，可作为铜绿假单胞菌检测的生物标志物。铜绿菌素的直接、即时检测能够极大程度降低临床上铜绿假单胞菌的诊断时间，提高
临床的效率&为实现以上目标，在本文中，我们通过静电吸附的机理在氨基硅烷化的玻片表面修饰一层AgNPs#构建了一种简单、价格低廉的具有表面增强拉曼效应的阵列传感平台，以实现培养基及唾液中铜绿菌素的直接、快速检测&结果表明铜绿菌素主要的SERS峰位主要为420,543,597,680,1354,1598和1615
cm1，其中用来进行定量分析的420cm1和1615cm1处拉曼位移分别归属于-CCN环弯曲和-C-N弯曲，及C=C环拉伸和C=N环拉伸。通过对肉汤培养基和唾液中的铜绿菌素直接检测，发现检测限分别为0.5
和0.35，远低于临床样本中铜绿菌素的检测浓度，每个样品的检测时间为10s&这表明我们所构建的
SERS基底阵列，具备适用于临床上铜绿假单胞菌代谢产物铜绿菌素的高灵敏即时检测的潜力&
关键词：表面增强拉曼光谱；铜绿菌素；铜绿假单胞菌；快速检测；阵列
中图分类号:O652.1文献标志码:A doi：10.13883/j issn1004-5929.202004004
SERS array toward point-of-care detection of
Pseudomonas aeruginosa metabolite
CHEN Yan1,CHEN Huan1,CHEN Zhoutian1,LI Yingying1,YANG Danting1*,SHEN Liliang2* "1M-edical Schoal of Ningbo University,Zhejiang Province,Ningbo,315000;
2The Jf f iliated People.Hospital of Ningbo University,Zhengjiang Province,Ningbo,315040)
Abstract:Pseudomonas aeruginosa which can lead to chronic clinical infection is an important pathog
enofburns#urEnarytractEnfectonandcystEcfbrosEs.Asthesecondary metaboltes producedby PCaeruginosa#pyocyanEn"PYO)cancausece l deathEnpatents wEthEnfec-
ton#closelyrelatedtohEgh mortalty.Therefore#thedErectandrapEddetectEonofPYO#as thebEomarkerof PCaeruginosa#EsabletoreducetheanalysEstEmeandEmprovethedEagnos-tic effect.Here,we constructed a SERS array platform using silver nanoparticles modified
g&asssidesviae&ectrostaticadsorptiontoachievethedirectandrapiddetectionofpyocyanin
inthecu&ture medium and sa iva.The resu&ts showed that#the main SERS peak shifts of PYO were main&y420#543#597#680#1354#1598and1615cm—1.The Raman shifts at420
cm—1and1615cm—1used for quantitative ana&ysis were respective&y a t ributed to-CCN ring bendingandClNringbending#aswe&asClCringstretchingandClNringstretching.
The limit of detection of PYO in broth medium and saliva were0.5y M,and0.35y M,re-spectively.ItisfarbelowthedetectionconcentrationofPYOinclinicalsamples.Thisshows
收稿日期：2020-06-19；修改稿日期：2020-11-02
作者简介：陈燕，女，宁波大学医学院，临床医学，本科生
通讯作者：杨丹婷，宁波大学医学院副教授，从事食品安全与生物医学的快速检测研究,E-mail:yangdanting@；沈立亮，宁波大学附属人民医院泌尿科副主任医师,E-mail:。
第4期陈燕：基于SERS阵列的铜绿假单胞菌代谢产物铜绿菌素即时检测313
thattheFurfacemodifiedSERSarray weconFtructedhaFthepotentialtobecapableofthe point-of-care detection clinically with high sensitivity of the metabolites of P.aeruginosa.
Key words:surface-enhanced Raman spectroscopy；pyocyanin；Pseudomonas aeruginosa；
rapid detection；array
1引言
铜绿假单胞菌(.Pseudomonas aeruginosa)在自然界广泛分布，在水、空气、正常人的皮肤呼吸道和肠道存在，最早由Gessard于1882年分离1，是一种机会致病者，且能分泌铜绿菌素等有害物质&有调查显示，桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染非常严重。据世界卫生组织(WHO)统计，人类70%〜80%的疾病都来源于不洁净的饮用水&铜绿假单胞菌也是医院内主要的病原体，存在于免疫功能低下的慢性患者，尤其是烧伤、囊性纤维化、泌尿道感染、支气管扩张等感染中，导致严重的发病率和死亡率(40
〜60%)⑵。铜绿假单胞菌的常规检测和鉴定目前主要有铺板培养法、流式细胞仪法、酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等方法。其中铺板培养法是金标准方法，具有很高的灵敏性和选择性，但它们非常耗时，通常需要24〜48小时。同时，抗生素不合理使用造成的细菌耐药性导致病人产生严重的并发症、成本增加和临床用药困难等问题&由铜绿假单胞菌污染导致的疾病依赖于对细菌早期、准确和快速的识别&因此，建立铜绿假单胞菌准确快速地早期检测方法是感染性疾病的重要前提和必要手段&
铜绿假单胞菌在生长过程中会分泌大量的生物毒素以保证其在宿主内的生存曰。在早期感染中，铜绿菌素(pyocyanin,PYO)是唯一能被铜绿假单胞菌分泌的次级代谢产物，可以作为检测铜绿假单胞菌的生物标志物。它是一种蓝的、具有氧化还原活性的含N芳香族化合物&铜绿菌素在环境中可以作为信号分子、毒性因子和微生物的媒介发挥作用，即使在复杂环境基质中，低浓度的细菌代谢产物也可被成功检测并用以识别被污染的水源或医疗器械等。临床上检测标本中PYO 的传统方法是通过氯仿提取然后采用高效液相质谱联用方法(HPLC-MS)测试，前处理耗时、昂贵和复杂的实验室程序在很大程度上限制了HPLC 作为临床诊断工具的使用因此开发成本低、快速、、灵度、性的PYO时测台，以省去实验室复杂处理程序，有助于快速获得患者的检查结果，辅助医生进行精准，是临床细菌检测迫切的需求&
表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)技术是近年来时兴的振动光谱技
术，具备高灵敏度、高分辨率、检测速度快、免标记、可提供生物样品指纹图谱的突出优势，满足病原菌快速检测需求&自2016年以来，SERS技术不断被应用在PYO的检测研究中，例如在金纳米颗粒覆盖的SERS基底上铺一层琼脂对铜绿假单胞菌生物膜的信号分子进行成像研究，或者结合微流控技术实现对PYO的检测&但是无论是成像还是实现微流控均需要额外的设备及专业人员进行操作，耗时长，临床样本往往需要进行氯仿前处理，不适用于即时检测的快速、便捷要求&因此，本文开发了一种低成本的SERS阵列以实现对复杂基质中PYO的快速即时检测。通过静电吸附的作用将银纳米颗粒稳定修饰于硅烷化的玻璃
灵度的SERS基，
处理可实现培养基和唾液中PYO微摩尔级别的直接快速检测&
2
2.1试剂与仪器
氯金酸(HAuCl•3H2O,99.9%)、硝酸银(AgNO3，%99.0%)、硼氢化钠(NaBH』，99.99%),3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，% 98%)、4-疏基苯甲酸(4-MBA,99%)、铜绿菌素(Pyocyanin)购于Sigma-Aldrich公司；甲醇(CH4 O)、无水乙醇(Q H s O)、柠檬酸钠(Na C6H5O7, 98%)购于国药集团化学试剂有限 公司；盐酸(HC1,37%)购于浙江中星化工试剂有限公司；硝酸(HNO3)购于兰溪市六洞山化工试剂厂；Hell-manex III购于Hellma GmbH；LB肉汤购于杭州微生物试剂有限公司&
氮气购于宁波东钱湖方辛炼气压厂；HOR卜BA XploRA ONE曼光购HORIBA Scientific公司；真空干燥箱、电热鼓风干燥箱购于上海一恒科学仪器有限公司；紫外可见光分光光浅卡
314光散射学报第32卷
度仪购于南京菲勒仪器有限公司；台式高速冷冻购于湖南赫西仪器装备有限公司；超纯水(1825'&・cmT)取自杭州永洁达净化科技有限公司的超纯水器&
2.2实验方法
2.2.1/、银纳米颗粒(AuNPs、AgNPs)的合成
AuNPs的合成：采用Frens G(15)发明的柠檬酸钠还原氯金酸方法合成。将2.5mL的10m'氯金酸溶液加入到97.5mL的去离子水中在磁力剧烈搅拌的同时加热到沸腾，快速加入1.5mL 1%酸钠溶液并继续加热搅拌30min。反应结束后自然冷却至室温。红的AuNPs合成后
有机冲施肥0.22p m后将其密封避光4C的
备用&
AgNPs的合成：采用Lee和'elsel(16)的方法略加改进合成而得。将102.9mg的柠檬酸钠溶解在45mL去水中，混合均匀，待溶腾后加入5mL硝酸银(1m')和10p L1m'硼氢化钠，继续加热并搅拌1h。反应结束后自然冷却
温。黄绿的AgNPs合成后用0.22口皿滤膜过滤后将其密封避光4C的备
2.2.2银纳米颗粒阵列制备
图1银纳米颗粒阵列示意图Fig.1SchematicofAgNPsarray
本文使用玻璃片作为SERS阵列的修饰基底，原因在于其稳定的物理、化学性质，有均一性，钝化性和有效性，成本低，表面易被。银纳阵列的下：1微：将普通的玻璃载玻装有2%的Hellmanex溶剂的塑料染盒中并超声1h，继而用200mL的去水超声5min共5次并用氮气吹干，然后将玻璃片没入200mL的甲醇/盐酸溶液(v：v=1：1)中在室温下震荡孵育1h，之后用200mL去离子水超声5min共5次并氮气吹干，方燥箱内100C烘干1h。2.氨基：将：后的玻片浸入到APTES/乙醇(1%v/v)内在60 C水浴加热30min使其氨基，结束后玻乙醇超声清洗5min共2次，最后放入120C 的燥箱内1h。3微纳米颗粒：燥后入备的AuNPs AgNPs溶中2h，氮气吹后性气的
燥中备&
2.2.3纳米阵列的表征
AuNPs和AgNPs胶体溶液及其阵列的消光光谱测量:I、-光光度计获得。取AuNPs或AgNPs胶体溶液于1mL比皿中进行吸光度的检测&玻片作为对照，将AuNPs AgNP阵的玻璃光光度计光的内进测。检测参数设置：扫描波长为300-800nm，分辨率为2nm。
玻片阵列的扫描电镜图像获取和分：有AgNPs的玻阵
HitachiSU-70电镜获得。
玻片阵列的拉曼成像：玻片阵列的均匀性测试使用Renishaw in V ia型显微共聚焦拉曼光获得。在样测前对拉曼光利：片(Si)在520.1cm B1峰作为基准峰进行仪器校准。
增强拉曼光光488nm，扫描光谱范围为400〜2000cm B1，分辨率为1cm B1，成像检测区域为7.5p mX7.510y L罗丹明60(1!')滴于玻片阵列上进曼成像&
2.2.4肉汤培养基及唾液中不同浓度PYO
的制备
第4期陈燕：基于SERS 阵列的铜绿假单胞菌代谢产物铜绿菌素即时检测
315
称取25 g LB 肉汤溶于1000 mL 蒸懈水中,
121 k 15 min 高压灭菌后，在培养基里加标不同
浓度的PYO，使其最终浓度为10 —5 M 、2 X 10 —6
M 、10—6 M 、2X10—7 M 、10—7 M 、5X10—8 M 。
取1 mL 正常人的唾液，在唾液中加标不同浓
度的PYO ，使其最终浓度为5X10 —5 M 、2X10 —5
M 、10—5 M 、5X10—6 M 、2X10—6 M 、10—6 M 。
2.2.5 样品的拉曼检测
使用HORIBA XploRA ONE 拉曼光谱仪获 得拉曼光谱。在样 测前对拉曼光 利 ： 片(Si)在520.1 cm -1峰作为基准峰进(器校
& 增强拉曼光 光 785 nm ,
激光强度设置为50%，功率为120 mW,50X 目镜, 曝光时间为60 s，扫描光谱范围均为400〜2000
cm —1，分辨率为1 cm -1。
AuNPs 及AgNPs 阵列的比较：移液取3 p L 1 mM 4-MBA 溶液各滴于表面修饰AuNPs 或A g -
NPs 的玻片阵列上，至少选取3个不同的位置进 行拉曼光 &
PYO 样品的SERS 光谱测量：移液取2. 5 p L 含有PYO 的培养基 唾液样本分别滴于修饰
AgNPs 的玻 阵 , 进 曼光 ，个样品至少
3次&
2.2.6 数据处理
(1) NGSLDbSpec5.0 对 曼光 数据的 处理，在进 曼 的 时，采用中的三 项
的基线自
功能减
背景&
(2) 使用 Origin 8. 0 软件和 Adobe Illustrator
软件对数 光谱图进行处理&
3结果与讨论
3.1 AgNPs 胶体及表面修饰AgNPs 的玻片阵列
的光学表征
紫外-可见分光光度计用来对合成的AgNPs
胶体溶液和修饰AgNPs 的玻片阵列进行光学表
&从图2a 出AgNPs 胶体溶液的消光光谱
在420 nm 有最大峰值；虽然修饰了 AgNPs 的玻
阵列的消光光
最强的峰值发生14 nm 的红
，但其 与AgNPs 胶体溶液的谱图相似，说
明AgNPs 成功 玻片上。同时，为获得最佳
度的SERS 基底阵列，我们对AgNPs 胶体溶 玻
的时间进 比较&结 明,
时间 2 时的玻 阵 光光
度最
，被选为样
测的最
时间&
R a m a n
mfellslfyKu.)
8
2\
6
o
o 20
晶粒度检测00
6002o
80
O
O 4X 17
.o
，
中
1
(a)
2
.O
媒体播放O.00
8
O
O 700
5
O O 4O O 3Wavenumber(nm) Raman Shift(cm )
图2 (a ) AgNPs 胶体及不同孵育时间下(1 h # h # h)的AgNPs 玻片阵列(GS)的消光光谱；(b ) a. AgNPs 阵列在617. 28
cm —1拉曼位移下的拉曼成像图R6G 的SERS 光谱图c AgNPs 玻片阵列的SEM 图像
Fig. 2
(a ) Extinction spectra of AgNPs array at different incubation time with Ag NPs colloidal solution (lh , 2h , 3h ) and Ag NPs colloidal solution ； (b ) a. Raman mapping of AgNPs array at 617. 28 cm —1 of R6G ； b. SERS spectra of R6G ； c.SEM of AgNPs array
3. 2修饰AgNPs 玻片阵列的拉曼表征首先我们比较了分别由AgNPs 和AuNPs 修 饰的玻片基底增
，从图3可以看出，AgNPs
修饰的玻片基底无论是从出峰的数量还是强度均
AuNPs
的玻片基底&
4-MBA 主要被增强的两个
曼
1069 cm -1
和
316光 散 射 学 报
第32卷
1577 cm —1处# 1577 cm —1处的拉曼强度，可知AgNPs 玻片基底的增
AuNPs
玻片基底的10倍。同时，为更好的检
测阵列的均匀度，我们对2 h 修饰的AgNPs 玻片 阵列进
SE'图像(图2b(b))及拉曼成像的表
征(图2b(a 、c))。从SE'的图像可看出,AgNPs 玻片上形成了较为均匀的阵列结构,AgNPs 的
大
38 nm，颗粒间的
间距约为
30 nm ；通过对1卩' 的罗丹明6G 617. 28 cm —1处
的拉曼峰进行7. 5 y mX7. 5 p m 的拉曼成像，也可 出图2b(a )中黑数据点较
匀的 ，证明
我们的阵列具备较好的数据点重复性&
•1TE/A 匸
s u o l u l
U E U I E H
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Raman Shift(cm -1)
图3 4-'BA 在AgNPs 和AuNPs 修饰的玻片阵列上
的 SERS 光
Fig. 3 SERS spectra of 4-'BA (1 '') on AgNPs
arrayand AuNPs array
3.3 PYO 的特征光谱
蓝的、具有氧化还原活性
的含N
化合物，其化学结
4(a )。
其在550〜800 nm 处有一个宽吸收峰，根 献
研究(7)，当选择785 nm 的拉曼激光
时，铜绿
共 曼增
应，获得高灵敏度的
曼信号&
4(b)所示，PYO 的拉曼光谱特征
峰分别位于 420,530,543,597,680,1354,1598 和
1615 cm —1等。其中,420 cm —1的峰主要归属于环
内扭曲，543 cm —1的峰主要归属于C-N 扭曲，597
cm —1的峰主要归属于C-C,C-N 和C-H 平面外弯
曲振动，680 cm -1的峰主要归属于环变形，1354
cm —1的峰主要归属于C-C 伸缩、C-N 伸缩和C-H
面内弯曲，1598 cm —1和1615 cm —1的峰主要归属
zne1
环变形,C-C 伸缩 内弯曲。 下来的培养基和唾液PYO 的SERS 检测中，我们将选择 自最强的
作为定量峰,
自的定量
。
3.4 LB 培养基中不同浓度PYO 的SERS 检测
为测试
的SERS 玻片阵列直
杂基质中PYO 的检测可行性，我们挑选 培养
胞菌的LB 培养基作为首选的测试基质,
其中加
水气分离器
浓度的PYO，使其最终浓度为
10—5 '、X10—6 '、10—6 '' X 10—7 '、10—7 '、
和5X10B 8 '。通过图5(a)可以看出，随着PYO 浓度的不断增加，420、543、1354、1598 cm —1处的
曼信号强度也随之增强。 曼位
下的 PYO 曼 度, PYO 浓 度 的 对 数
坐标，SERS 信号强度为纵坐标，可得 曼位
移下，PYO 浓度和SERS 信号强度之间的线性关
。
比较四个拉曼 下所得的线性相关系
数可得，当拉曼位移为420 cm —1时，R2为0.959,
相关系数最大，被选 培养基溶液中的定量峰。
(a)
ch 3
o
300 400
500 600 700 800
Wavelength(nm)
(.tTE)ooUEq.Iosqv
图4 (a ) PYO 的吸光度光谱和结构式；(b ) PYO 水溶液的SERS 光谱(10卩')
Fig. 4 (a ) Absorbance spectrum and chemical structure of PYO ； (b ) SERS spectrum of PYO in aqueous solution (10 ''
)
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