选择正确的缓冲液

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右表所示为常用缓冲溶液系统表。表中列出一部分常用缓冲溶液及其相应的pH值。其中，最常用的是磷酸盐。作为一种缓冲溶液，当不同pH值的样品加入到其中时，应当具有保持pH稳定的能力。同时，缓冲溶液的缓冲容量为酸或碱的pK值上下浮动100%。在pH＝4时，磷酸盐时一种弱的缓冲溶液，如果一种酸性或碱性更强的样品加入到其中，其pH值会迅速朝着它的一个pKa值变化。

通常，为保持流动相pH值的稳定，流动相的pH值应控制在其pKa±1的范围之内。在HPLC中，常用的缓冲溶液浓度为10-100mM。具体的浓度取决于样品的尺寸和性质，以及谱柱的填料。通常，含有极性基团的固定相，如Hypersil Gold aQ，比传统的烷基填料更适于在稀的缓冲溶液中使用。

若想控制流动相在一个低的pH值范围(2-3)，通常会选择使用磷酸盐、或较强的有机酸，如TFA或醋酸。若希望控制在pH4-5，醋酸盐或柠檬酸盐而不是磷酸盐，是通常考虑使用的试剂。

右图所示为pH值选择对分离的重要性。如果不能正确缓冲，即使pH值微小变化，由测量的误差、泵混合物或者流动相吸收空气中的水所造成的变化，都会改变方法。

当选择一种缓冲溶液和有机溶剂混合时，应注意它们的互溶性，避免出现混合后缓冲盐结晶析出从而造成系统污染的情况。

订货号

流动相

流量

检测

实验完成后，应及时冲洗仪器和谱柱，以防止缓冲盐沉积在系统或筛板上。

常用缓冲溶液系统

缓冲溶液		pKa	pH有效缓冲范围	是否适用与MS
三氟乙酸		0.30		是
磷酸盐	pK1	2.1	1.1-3.1	否
	pK2	7.2	6.2-8.2	否
	pK3	12.3	11.3-13.3	否
柠檬酸盐	pK1	3.1	2.1-4.1	否
	pK2	4.7	3.7-5.7	否
	pK3	5.4	4.4-6.4	否
甲酸盐		3.8	4.4-6.4	是
醋酸盐		4.8	3.8-5.8	是
三氨基甲烷盐酸缓冲液		钛靶材8.3	7.3-9.3	是
氨		9.2	8.2-10.2	是
硼酸盐		9.2	8.2-10.2	否
二乙胺		10.5	9.5-11.5	是
碳酸盐	pK1	6.4		是
碳酸盐	pK2	10.2		是
三乙醇胺		7.80		是

pH的微小变化对微离子化混合物分离的影响

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LC/MS缓冲溶液选择

缓冲溶液的选择很大程度上取决于所使用的仪器和分析物。理想地，LC/MS系统中应使用易挥发的缓冲溶液以避免形成污染源极的沉积。无机酸、不挥发的缓冲溶液以及离子对试剂应避免使用。常用的LC/MS缓冲溶液包括：

●醋酸铵/甲酸盐/碳酸氢盐(<50mM)

●甲酸/醋酸(0.01-1%v/v)

●三氟乙酸(<0.1%v/v)

●叔胺(<0.1%v/v)以及氨型碱溶液

●TRIS

●BIS-TRIS丙烷

提示：我公司可提供LC/MS仪器，如 Finnigan™ Surveyor™ MSQ™ LC/MS。该系统中加入了自清洗装置以减小常规使用中无机盐在源极上的累积。使用过程中应当注意，不要故意过度污染仪器的源极，因为这可能会导致操作上的问题。

流动相的准备

正确准备溶剂是十分重要的，它能在减少鬼峰和基线噪声问题上，节约大量时间。

质量

所有溶剂都应是高纯度的，HPLC级的溶剂的价格会比其它纯度的溶剂稍贵一些，但是它们的纯度是不同的。HPLC级溶剂一般不会产生鬼峰，而其它级溶剂可能会由于杂质的存在而产生鬼峰。

保证配制流动相的水的纯度足够高，由于去离子水经常含有一些有机化合物，因此不推荐用于HPLC中。超纯HPLC用水（18MΩ）是由去离子水通过离子交换床得到。现代的水净化仪器即是利用这一机理来大量生产这种纯水。HPLC纯水也可以从溶剂经销商处买到。

重要提示：不要把HPLC纯水存放于塑料容器中，因为塑料中的添加剂可能会渗入水中造成污染。通常用玻璃瓶存储HPLC纯水。

缓冲溶液

所有的缓冲溶液都应是现用现配的，这样能确保不会因为缓冲溶液储藏时间过长使流动相的pH受到影响，同时也可避免微生物生长。pH的改变和微生物都可能会影响谱分离效果。

缓冲溶液储存应该有一定的时间限制。药典或者相关的资料都有一些相关要求。

缓冲溶液可能包含稳定剂，例如：硫代硫酸钠。这些稳定剂可能会影响缓冲溶液在光学和谱方面的性能，因此，比较理想的是购买没有添加稳定剂的溶剂。重复使用的固体试剂容器很容易被污染。所以推荐买小容量容器装溶剂。

过滤

理想情况下，要求所有HPLC用溶剂都应通过0.45μm的滤膜过滤后再用。这样能够有效防止微粒导致的堵塞。过滤后，应把溶剂放在一个密封的容器中，防止灰尘等所造成的重新污染。过滤后的溶剂既可做谱分析，也可冲洗系统。譬如，泵头、柱塞杆、单向阀和密封圈，都应该最大程度上处理好，保持良好性能状态。

脱气

在流动相进入HPLC系统中之前，应首先脱气。常用的流动相脱气方法有：

●氦气脱气

●超声脱气

●真空脱气。

如果流动相没有脱气，那么进入到高压系统的气泡会使系统不稳，出现鬼峰等。

流动相中的气体引起的基线噪声

氦气或其他低溶解度气体是有效的脱气方法，流动相连续脱气可以防止空气重新溶解在溶剂中从而对实验产生影响。

注意：确保溶剂瓶里有孔与大气相通，以防止溶剂瓶内部有压力。

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溶剂性质(vs硅胶)

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溶剂	溶剂强度1	极性指数	紫外截止2 (nm)	折光率2	粘度3 (cP,20℃)	沸点3(℃)	水溶性(w/w%)
氟利昂
正己烷
异辛烷
正庚烷
正癸烷
环己烷
环戊烷
1- 氯丁烷
正丁醚
邻二甲苯
异丙醚
甲苯
甲基叔二丁醚
正丁醇
氯仿
二氯甲烷
甲基丁基酮	双立柱卧式带锯床
四氢呋喃							互溶
环己酮

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