浙Ⅱ＾掌博±掌ｍ论ｉ黄常新
瘤苗英文缩写
（Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｕｍｏｒｖａｃｃｉｎｅｓ）
Ｂ１６：ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｗｉｌｄ－ｔｙｐｅＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ
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博士生黄常新
导师余海教授曹雪涛教授
专业：肿瘤学
中文摘要
长期以来研究者试图以灭活的肿瘤细胞作为瘤苗来提高肿瘤细胞免疫原性，激活抗肿瘤的特异性免疫， 但是未经修饰的野生型肿瘤瘤苗效果并不理想。于是研究人员对肿瘤细胞进行各种修饰，使瘤苗的免疫原性和抗肿瘤作用得到了进一步的提高；由于采用的策略不同，所修饰的瘤苗激发免疫反应的方式和强度也不同。已知Ｔ细胞介导的抗肿瘤免疫反应，特别是ＣＴＬ作用，在抗肿瘤免疫中起主要作用，所以，抗肿瘤ＣＴＬ作用在瘤苗的研究中也就倍受注重。但由于不同的肿瘤有不同鹤突变的ＣＴＬ表位，ＣＴＬ作用不具备通用性，且其分离和鉴定也极其繁琐。
热休克蛋白（ＨＳＰｓ）是一类广泛存在又高度保守的分子伴侣家族，近年来发现在热应激时能大量合成的ＨＳＰｓ在肿瘤抗原递呈中起着重要作用。某些ＨＳＰｓ具有结合肿瘤细胞内的肿瘤抗原多肽（ＣＴＬ表位）形成ＨＳＰ一抗原肽复合物的特性，该复合物可通过与抗原提里细胞（ＡＰＣ）表面的ＨＳＰ受体相结合而内吞进入ＡＰＣ。与通常的ＡＰＣ对外源性抗原的处理方式不同，此时的肿瘤抗原肽主要由ＭＨＣＩ类分子以稳定的“ＨＳＰ－多肽．ＭＨＣＩ复合物”形式提呈在ＡＰＣ表面供ＣＤ８＋Ｔ细胞识别并话化。从而诱导抗肿瘤的特异的ＣＴＬ反应。其中，具有代表性的是通常表达于胞浆中的ＨＳＰ７０。ＨＳＰ诱导的特异免疫不是由于ＨＳＰ的多样性。而是由于ＨＳＰ结合了特异的多歇而呈多样性的ＨＳＰ驮复合物。所以，热休克蛋白在瘤苗中使用具有独特的优越性：无需鉴定和分离肿瘤抗原，且不受肿瘤抗原的调变的影响：ＨＳＰ还具有诱导ＤＣ成熟活化，促进分泌细胞因子，传递信号和增强肿瘤细胞免疫原性等作用，并己为临床和实验肿瘤所证明。但是，现有的ＨＳＰ全细胞瘤苗研究是基于ＨＳＰ肽复合物分泌于癌细胞外或瘤细胞死后释放的，这不利于ＨＳＦ抗
捕虾机电路图原肽复合物与专职ＡＰＣ膜上受体相互作用；同时，癌苗细胞局部的免疫环境也会影响ＨＳＰ诱导抗肿瘤特异的
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金属丝的杨氏模量
ＣＴＬ反应，这些也许是应用ＨＳＰ产生的抗肿瘤ＣＴＬ反应的强度不能令人满意的重要原因。
近年发现的细菌或病毒所产生的一类蛋白，具有特殊的免疫原性而称之为超抗原，超抗原可不经ＡＰＣ处理而可直接活化Ｔ细胞，因其有强大而广泛的免疫激活作用而倍受关注，超抗原的抗肿瘤应用研究也取得了重要进展。马文学等将Ｃｅｒｂ－Ｂ－２的跨膜区编码序列与金葡菌肠毒素Ａ（ＳＥＡ，一种典型的超抗原）编码序列融合，使之在细菌中表达，得到融合蛋白ＳＥＡ－ＴＭ。它能以跨膜区锚定在肿瘤细胞表面，因而限制了超抗原的ＭＨＣ１１分子结合端，减少了其对ＡＰＣ的损伤。降低了毒副作用，仍然能够发挥强大的免疫活化作用。但超抗原的免疫激活主要是非特异性免疫活化，并不针对特定的肿瘤抗原，而且单独、全身使用有诸多的毒、副作用。
基于上述的背景，我们设想能否用膜表达型ＨＳＰ７０基因修饰肿瘤细胞，将肿瘤抗原肽（ＣＴＬ表位）从肿瘤细胞内携带出来，与ＨＳＰ７０形成复合体共同表达在肿瘤细胞表面，提高局部ＨＳＰ抗原肽复合物的浓度，从而利于ＡＰＣ的活化，促进机体产生特异性抗肿瘤免疫。同时设想以蛋白转染法将超抗原锚定在瘤细胞膜上。在瘤苗细胞周围产生的强大的免疫活化效应，使大量的淋巴细胞、Ａ
ＰＣ细胞和细胞因子聚集在瘤苗细胞周围，打破局部免疫抑制，使肿瘤细胞周围的微环境更有利于产生特异性抗肿瘤免疫反应，包括激活特异性ＣＴＬ。这样，瘤苗细胞表面的ＨＳＰ与超抗原可以较好地发挥互补的特异性和非特异性免疫反应。产生协同的抗肿瘤效应。并可避免超抗原对免疫系统过度激活，减少毒副作用。
超抗原ＳＥＡ的第２２７位上的氨基酸既是ＳＥＡ的ＭＨＣＩＩ类分子结合区又是致吐功能位点，将该位点的天门冬氨酸突变为丙氨酸，既可降低超抗原与ＡＰＣ上ＭＨＣＩＩ类分子的结合力，达到减少超抗原对ＡＰＣ损伤之目的又可减少超抗原的其它副作用。故本课题拟对膜型超抗原ＳＥＡ—ＴＭ定点突变，将第２２７位上天门冬氨酸突变为丙氨酸，制备膜型超抗原突变体一ＳＥＡ－ＴＭＤ２２Ｍ代替融合蛋白ＳＥＡ．ＴＭ锚定在瘤菌细胞表面，以进一步减小超抗原的毒副作用。
本课题研究目标为：通过基因转染使ＨＳＰ７０表达于小鼠黑素瘤Ｂ１６的细胞膜上；同时通过蛋白转染法，将突变的ＳＥＡ－ＴＭ锚定于瘤细胞膜上，制备细胞膜表面双重修饰的瘸苗并研究其抗肿瘤作用和机理。研究内容包括：（１）构建ＨＳＰ７０的膜表达载体，转染肿瘤细胞后，筛选并扩增阳性克隆，制成ＨＳＰ７０膜表面表达的单修饰窟茵：（２）将带有跨膜序列的超抗原ＳＥＡ－ＴＭ用ＰＣＲ方法定点突变，构建成其膜型超抗原突变体ＳＥＡ．ＴＭＤｍＡ的原核表达载体，进一步表达并制备膜型超抗原突变体蛋白。（３）将膜型超抗原突变体蛋白锚定于ＨＳＰ７０膜表面表达的肿瘤细胞上，制成双重膜表面修饰的瘤苗；（４）在小鼠移植瘤
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模型上，分别使用单一和双重膜修饰瘤苗，观察瘤苗的抗肿瘤作用。
本研究分为三个部分：
第一部分：细胞膜表面表达ＨＳＰ７０的瘤苗的制各及其抗肿瘤研究
１、膜表面表达ＨＳＰＴ０的真核表达载体的构建
ＨＳＰＴ０正常表达在肿瘤细胞浆中，为使ＨＳＰ７０表达到细胞膜表面，形成ｍｅｍｂｒａｎｅ．ｂｏｕｎｄＨＳＰ７０（ｍｂＨＳＰ７０）需要在ＨＳＰ７０基因的启始密码予前添加信号肽序列，在ＨｓＰ７０基因的尾端融合跨膜序列。根据ＨｓＰ７０的基因序列，设计一对引物Ｐｌ和Ｐ２：上游引物Ｐｌ包含ＳａｃＩＩ酶切位点，下游引物Ｐ２包含ＳａｌＩ酶切位点。以ＲＴ－ＰＣＲ方法，从人胚肾组织中ｍＲＮＡ获得人源的ＨＳＰ７０全长ｅＤＮＡ。因载体ｐＤｉｓｐｌａｙ在酶切位点的上游有小鼠ｋ链信号肽序列，酶切位点的下游有血小板来源的生长因子受体（ＰＤＧＦＲ）跨膜序列，故将ＨＳＰ７０ｅＤＮＡ直接构建插入质粒载体ｐＤｉｓｐｌａｙ的ＳａｃＩＩ和ＳａｌＩ酶切位点之问。经测序证实，信号肽序列和跨膜序列分别位于ＨｓＰ７０基因前、后两端。构建的ＨＳＰ
７０膜表面表达的ｐＤｉｓｐｌａｙ载体，既能在原核细胞中表达。也能在真核细胞中表达。设计另一对分别含ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩｌ酶切位点的引物．同样方法获得的ＨＳＰ７０ｅＤＮＡ插入载体ｐｃＤＮＡ３．Ｉ（－）Ｂ中，构建出胞浆表达ＨＳＰ７０的ｐｃＤＮＡ３．１（一）Ｂ。
２、膜表面表达ＨＳＰ７０的瘤苗的制备
用脂质体转染方法，使用ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ＠ｌ［｝ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ，将ｍｂＨＳＰ７０转染到黑素细胞瘤Ｂ１６细胞中．用Ｇ４１８（１１００ｕｇ／ｇ）抗性筛选４周，获抗性克隆。ＲＴ－ＰＣＲ后电泳证实ＨＳＰ７０膜表达和胞浆表达的转染细胞（分别以Ｂ１６－ｍｂＨＳＰ和Ｂ１６－ＨＳＰ表示）内ＨＳＰ７０的ｍＲＮＡ均高表达。以鼠抗入ＨＳＰＴ０单抗和ＦＩＴＣ标记的抗鼠Ｉｇ二抗标记后，以流式细胞术、激光共聚焦显微镜观察检测Ｂ１６－ｍｂＨＳＰ表面ＨＳＰＴ０的表达。经有限稀释培养获得单克隆来源的阳性Ｂ１６细胞，同时以空载体转染的Ｂ１６以及野生Ｂ１６（分别以ｍｏｃｋ－Ｂ１６和Ｂ１６表示）作为对照。
肿瘤细胞体外培养时，未灭活的Ｂ１６一ＨＳＰ和Ｂ１６－ｍｂＨＳＰ细胞与对照细胞的生长速度相近。以Ｂ１６－ＨＳＰ７０和Ｂ１６．ｍｂＨＳＰ７０细胞接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠后，分别有２５％和３７％的小鼠的肿瘤出现消退现象，而对照组的成瘤率为１００％，不出现肿瘤消退现象。这表明转染了ＨＳＰＴ０和ｍｂＨＳＰＴ０的肿癯细胞的致瘤性有不同程度的下降；各肿瘤细胞在体内
磁卡制作生长受到的抑制并非由细胞本身不同生长速度所致。转染后的Ｂ１６肿瘤细胞稳定传代扩增，收获后在含丝裂霉素（ＭＭＣ）１００ｖｇ／ｍｌ的培养液中３７。Ｃ孵育一小时灭活，ＰＢＳ洗涤三遍调整为ｌｘｌ０６个／ｍｌ瘤苗细胞备用。
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