• 28•国际生物制品学杂志202〗年2月第44卷第1期Im J Biologicals，February 2021，Vol. 44, No. 1
•论著•人JL-2与H B sA g融合基因重组卡介苗的 构建与鉴定
王子豪于沛伶潘玉成李运清刘昂薛庆节
济宁医学院基础医学院272067
cagaa通信作者：薛庆节，Email: q j x u e************
【摘要】目的构建人JL-2与H R s A g融合基因并转化到B C G中构建重组B C G(rec〇mbinam
B C G，r B C G)，为制备和预防乙型肝炎和结核病的二联疫苗奠定基础。方法以IL-2 pMalLP质粒 和H B s A g pMalLP质粒为模板，设计引物，利用P C R技术扩增R B A g和JL-2基因，进行重叠P C R获 得融合基因并纯化，将融合基因克隆至穿梭表达载体PMV261得到重组质粒，电转化导
人B C G感受态细胞，以蛋白质印迹法检测融合基因在r B C G中的表达。结果P C R扩增得到JL-2和•，通过重叠P C R获得融合基因后成功插人穿梭表达载体，r B C G能表达融合蛋白。 结论构建人JL-2与H R d g融合基因重组质粒并导人B C G，获得了稳定表达融合蛋白的r B C G。
【关键词】白细胞介素2；肝炎病毒，乙型；重组融合蛋白质类；卡介苗；肝炎表面抗原，乙型
基金项目：山东省重点研发计划项目（2018G S F U8137)；山东省医药卫生科技发展计划项目
(2017W S339)；山东省高等学校科技计划项目（J17K B085 )；济宁市重点研发计划项目
(2019S M N S020)；济宁医学院重点项目（16008)；贺林院士工作站重点项目（J Y H L2019Z D03)；济宁医
学院大创项目（C X2018007，C X2019102)
【中图分类号】R373. 2 + 1DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200609-00()67
Construction and identification of recombinant BCG with human I L-2and H B s A g fusion gene
Wang Zihao，Yu Peiling，Pan Yucheng，Li Yunqing，Liu Arig，Xue Qingjie
Basic Medical College-, ] ining Medical University, J ining 272067 f China
Corresponding author：Xue Q ingjie,Email：****************
【Abstract】Objective To construct the fusion gene of human IL-2and HBsAg and transform into
BCG for expression, laying foundation for preparation of bivalent vaccine for prevention and treatment of
hepatitis B and tuberculosis. Methods Using IL-2 pMalLP and HBsAg pMalLP as templates, primers
were designed. HBsAg and IL-2genes were amplified by PCR, and then the fusion gene IL-2-HBsAg
was obtained by overlapping PCR and purified. The fusion gene was cloned on the shuttle expression
vector pMV261 to obtain the recombinant plasmid, and then transformed into BCG sensitive cells by
electroporation, and the expression of the fusion gene in recombinant BCG (rBCG) was detected by
Western blot. Results IL-2(453 bp) gene and HBsAg(618 bp) gene were amplified by PCR, and IL-2-
HBsAg(1 179 bp) fusion gene was amplified by overlapping PCR. The fusion gene was successfully
inserted into the shuttle expression vector. The fusion protein was detected in rBCG. Conclusion The
recombinant plasmid of human IL-2and HBsAg fusion gene is successfully constructed and introduced
into BCG to obtain rBCG which can stably express the fusion protein.
【Key words】Interleukin-2; Hepatitis B virus；Recombinant fusion proteins；BCG vaccine；
Hepatitis B surface antigens
Fund programs：Key R&-D Programme of Shandong Province(2018GSFl 1813) ；Medical and Health
Technology Development Plan Project of Shandong Province (2017WS339) ； Project of Shandong Province
Higher Education Science and Technology Program (J17KB085)；Key R&D Programme of Jining City
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(2019SMNS)20) ； Key Project of Programme Jining Medical University(16008) ； Research Fund for Lin
HeT s Academician Workstation of New Medical and Clinical Translation (J YHL2019ZD03); College
Students’Innovation and Entrepreneurship Project of Jining Medical University ( CX2018007,
CX2019102)
DOI：10. 3760/cma. j. cn311%2-2()2()()6()9-()0()67
目前全世界H B V携带者约3. 5亿，每年超过 78万人死于H B V感染性疾病，而中国又是乙型肝 炎的高流行地区，据统计，中国H B V感染者约为 1.2亿，H B V携带率约7. 09%[1]。H B V感染的临 床状态多样，可表现为重型肝炎、慢性肝炎或无症状 携带，其中一部分慢性肝炎最终会发展成为肝硬化 或肝癌，因此预防H B V感染十分重要。H B V产生 的HBs A g为糖基化蛋白，含有B细胞、特异性Th 等多种免疫细胞的识别表位，有刺激机体免疫系统 产生免疫应答和免疫记忆的能力；而人IL-2可增强 T细胞的杀伤活性、自然杀伤细胞的活性以及CTL 的杀伤作用，同时T h l细胞产生的IL-2可加强 B C G的免疫保护作用。 本实验目的是制备能稳定表达IL-2-H RsAg融 合蛋白的重组 BCG(recombinant B C G,rBCG)，为研发
预防和乙型肝炎和结核病的二联疫苗奠定 基础。
1材料与方法
1.1主要试剂
限制性核酸内切酶£«)R I、S d I、B_H I，T4 D N A 连接酶，D N A marker 2()(M)，D N A marker 5()()(>购自宝生物工程(大连)有限公司;PCR Master Mix预混液、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂 盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Middlebrook 7H9 Agar、Middlebrook 7H9 Broth、Middlebrook A D C增菌液购自美国B D公司；彩预染蛋白质相 对分子质量标准(1() 〇〇〇〜000)、辣根过氧化物 酶标记兔抗小鼠IgG二抗购自上海碧云天生物技 术有限公司；小鼠抗人IL-2单克隆抗体购自英国 Abeam公司。
1.2菌株
感受态大肠埃希菌D H5a和B C G上海丹麦株 由济宁医学院基础医学院研究室保存。
1.3质粒
n.-2 pMalLP 和 HBsAg pMalLP 质粒为北京 中原公司产品；PM V261(穿梭表达质粒）由济宁医 学院基础医学院研究室保存。
1.4质粒提取
使用液体培养基培养含IL-2 pMalLP质粒 和HBsAg pMalLP质粒的大肠埃希菌，37 °C、160 r/min过夜，使用质粒小提试剂盒提取质粒，分 别得到含/L-2和基因的质粒。皮带盘
1.5目的基因扩增
1.5. 1引物设计以图1的技术方案设计并扩增 目的基因。
根据美国国家生物技术信息中心（NCBI)提供 的JL-2基因序列设计扩增目的基因所需引物的序 列，在5'端引入£m R I酶切位点，并在下游引物引 入多肽连接体（Gly4Ser)3: 5'-GCTGCCGCCACC G CCG C TTC CGCCACCGCCGCTTCCACCGCCAC C-3，。F1为 5，-C C C G A A T T C A T G A A A A T A A A A A C-3，；R1为 S'GCTGCCGCCACCGCCGCTTC CGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTTGATGA G T T A G T G T T G A G A T G A T G d。
根据NCBI提供的基因序列设计引物
序列，在Y端引人B a w H I酶切位点，并在其上游 引物引入多肽连接体（Gly4Ser)3。F2为5'-GG T G G C G G T G G A A G C G G C G G T G G C G G A A G C G G C G G T G G C G G C A G C A T G G A G A A C A T C A T C A G G A T T C C T A G G-3,；R2 S'-CGCGGATCCTTAA A A T G T A T A C
C C A A A G A C A A A A03,。
FI IL-2R1 F2 HBsAg R2
接头D N A j接头D N A
HBsAg R2
F2
FI 融合基因____________R2
图1重叠延伸P C R获得/L-2-H B sA g融合基因的示意图
1.5.2目的基因扩增分别以IL-2 pMalLP质粒 和HBsAg pMalLP质粒为模板，以F1和R1、F2和 R2为引物，P C R扩增目的基因。反应条件:94°C 4 min,94 °C30 s,56 °C 30 s,72 °C30 s(IL-2)/ 1 min (HBsAg )，扩增30个循环；再72 °C延伸5 min。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳测定后用
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凝胶回收试剂盒进行回收。
1.5.3 融合基因的获取将获得的/L2和
基因以T4 D N A连接酶连接，连接体系为: IL-2 20 pUHBsAg 20 "1,T4 D N A连接酶 2 "1，T4缓冲液（l()x)5 f_J，以蒸馏水补至5(> Ml，置于16 °C 过夜。以连接后的融合基因为模板、以F1和R2为 引物进行重叠P C R扩增融合基因JX-2-HB.sAg■，方 法同1.5.2，扩增产物经().8%琼脂糖凝胶电泳检测 后用凝胶回收试剂盒进行回收。
1.6重组质粒的构建、筛选与鉴定
将融合基因1L-2-HRs'A g与穿梭表达质粒
P M V261分别用限制酶&〇R I和也/^^1进行双酶切，37 °C过夜。酶切产物经U.8%琼脂糖凝胶电
泳分离后用回收试剂盒按操作说明进行回收。再用 T4 D N A连接酶将回收的儿-2-HBi'A g和P M V261 质粒按摩尔比3 :1进行连接，连接体系为：^^-2- H&A g20 jul，p M V261 2(> /_J,T4D N A连接酶 2 p l，T4缓冲液（10 X )5 y l，以蒸馏水补至5() 后置于 16 °C过夜。将连接产物转化到感受态细胞D H5a 中。
取转化并复苏后的D H5a2()()W接种于L B固体
培养基(含50 f z g/ml卡那霉素)进行筛选，同时设置 对照组(D H5a细胞)，共同置于36 °C环境下24 h后，取试验组中含有卡那霉素抗性的菌落大量扩增后用 质粒小提试剂盒按说明书提取质粒后进行双酶切鉴 定和P C R鉴定，并送生工生物工程(上海)股份有限 公司进行测序鉴定。
rs232和ttl1.7 rBCG的构建
1.7.1 B C G感受态细胞制备将B C G在
Middlebrook 7H9 液体培养基中 37 °C、150 r/min
人造板热压机培养至对数生长期(600 n m吸光度值为(>.60)。冰 浴2 h后4 °C、8 ()()0X g离心15 min弃上清液，再 用质量浓度1()%的甘油重悬菌株；重复以上操作5 次即获得B C G感受态细胞。
1.7.2 B C G的电转化将感受态B C G置于冰上
解冻，待感受态细胞融化后取W感受态细胞悬 液与1()卩1重组穿梭质粒重悬混匀，置于冰上15 min。将混合的液体转入预冷的U.4 c m电转杯的 缝隙中，把电转仪的电转模式调至Ec2进行电转，参数为电压2.5 k V、时间4.9 ms。电转后把电转杯 立刻拿出并加入900 ^1 Middlebrook 7H9液体培养 基并快速重悬电转杯缝隙内的细胞。将重悬的细胞 转移到E P管中，37 °C、150 r/min过夜培养使其复苏。
1.7.3 B C G的筛选取细胞悬液10 均匀涂布到Middlebrook 7H9斜面培养基上(含5(> )ug/ml卡 那霉素），置于37 °C培养箱中培养。2〜3周后长出 菌落，收集菜花状菌落接种于Middlebrook 7H9液 体培养基（含5(>邱/m l卡那霉素），37 °C、15() r/m m培养，2〜3周后提取质粒，P C R扩增融合 基因鉴定rBCG。
1.8对照组的设置
将空质粒P M V261电转化导入B C G，按照1. 7 进行操作，电转电压2.5 k V，电转时间5. 1 ms。
1.9 融合蛋白的诱导表达
将含重组质粒的r B C G接种于Middlebrook 7H9液体培养基中(含5()卩g/m l卡那霉素）培养至 对数生长期，迅速将其转到45 °C摇床中进行热诱导 5(> min，连续诱导3 d。诱导完毕后12 ()()()X尽、3 min离心收集菌体，超声破壁后使用放射免疫沉淀 试验裂解液提取蛋白。
1.1〇目的蛋白检测
取获得的蛋白提取液进行十二烷基硫酸钠-聚 丙烯酰胺凝胶电泳，其中设置B C G空转质粒(PMV261)和B C G两个对照组。利用湿转法进行 转膜再进行封闭、杂交和曝光，其中一抗分别使用抗 人IL-2和抗HBsAg小鼠单克隆抗体，二抗使用辣 根过氧化物酶标记的兔抗小鼠抗体。
2 结果
2.1目的基因的扩增和鉴定
PCR 扩增的 H B.s Ag(618 bp)和 JL-2(453 bp)基因片段经a 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小与理 论大致相同。利用重叠P C R，以F1和R2为前后引 物扩增融合基因经凝胶电泳鉴定，得 到的融合基因片段与理论片段长度（1179 bp)大致 相同（图2)。
2.2重组质粒的构建和鉴定
穿梭质粒与融合基因连接并转化到感受态细胞 后，提取重组质粒做E m R I I的双酶切鉴 定，经电泳分析获得片段长度约为1.2 kb和4.5 kb 的酶切片段（图3)，即融合基因已成功连接到穿梭 质粒。
以IL-2的前引物F1和H B s A g的后引物R2 为融合基因的引物，以得到的重组质粒为模板对目 的片段进行扩增，电泳测定P C R后的产物大小约为 1.2 kb(图4)，与理论值基本一致。
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bp 2000
1000 750
500 250
100
bp
2 000
1000 750 500
250
100
bp
5 000
3 000
2000
1 500
1000
750
500
注：M: D N A marker 5(X X);
1：重组质粒P C R产物
图4重组IL-2-HRsAg质粒的P C R鉴定
经检测，重组穿梭表达质粒的碱基序列与
NCBI提供的序列基本一致。
2.3目的基因的表达
PPPOE 协议对诱导rBCG表达的融合蛋白进行蛋白质印迹
法检测目的蛋白是否表达。结果转入重组质粒的
rBCG表达IL-2阳性和H B s A g阳性，而B C G空转
质粒组和B C G组为阴性（图5)。
©
ft： M： D N A marker 2000；
1—3：目的基因P C R产物
图2 P C R扩增目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳A P C R扩增 •基因B P C R扩增JL-2基因 C重叠P C R扩增几-2-
融合基因
bp M1
5 000
3 000
2000
1 500
1000
750
500
注：M: D N A marker 5()()();
1：经I、I 双
酶切的重组质粒
图3重组IL-2-HBsAg质粒双酶切鉴定
12 3 4
注：1: B C G对照组；2：重组B C G+抗H B s A g抗体杂交组；
3：重组B C G+抗IL-2抗体杂交组；4: B C G空转质粒组
图5重组B C G表达产物的蛋白质印迹法分析
3讨论
近年来，采用基因工程方法构建重组质粒使其 表达相应蛋白以诱导机体产生免疫力的方法已被众 多研究验证[2]。众多学者对A P C和其细胞因子进 行了较为深入的研究，其中IL-2是一种重要的细胞 因子，研究表明IL-2可使T细胞、自然杀伤细胞等 免疫细胞活化并促进免疫细胞的形成与增殖[>4]，使 机体免疫细胞在肿瘤免疫和其他细胞免疫中产生效 应，促进人体免疫细胞发挥更加强烈的吞噬病毒或 癌细胞的作用。K a n g等的研究显示，IL-2较其 他细胞因子如TNF-a具有更强的加强B C G免疫保 护的作用，因此IL-2的表达可能激活免疫细胞并对 免疫细胞有较强的趋化作用。我们拟利用IL-2的以上作用来加强机体免疫细胞对抗原的摄取、提呈 和免疫记忆，
从而加强机体免疫能力。
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众多研究表明，H B s A g可被单核巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞识别并产生免疫记忆和抗 H B V感染能力M，因此HBsAg可成为H B V相关 疾病免疫的理想靶标。若将基因与其
他可增强免疫细胞识别能力的基因联合转入载体使 其表达此抗原，则可诱导机体产生更强的HBsAg 特异性免疫力，以此预防并对抗H B V感染。此研 究在H B V持续感染和疫苗制备等方面均有重要作 用[8]。
B C G是应用近百年的减毒结核分枝杆菌活疫 苗，可作用于巨噬细胞和A P C调节T M与Th2的比例，对人和动物可作为强疫苗佐剂，增强机体产生 的免疫应答。同时，大量动物实验表明，rBCG 可以在正常体温下稳定表达目的基因及B C G自身 的抗原[1M1]。因此以B C G作为本研究的载体，提高 了研究速度和成功率。同时，B C G内的多糖核酸对 IL-2的产生和表达有促进作用。因此，r BCG可使 机体表达产生的免疫力和免疫记忆。比较时坤 等[|«利用rBCG对牛进行的免疫效价评价和吴闻 哲等「1«利用重组H B V对小鼠进行的免疫效价评价 表明，机体对免疫rBCG产生的抗体效价明显优于 目前临床应用的H B V疫苗。
大量前期研究表明，与单基因相比，双联甚至多 联融合基因表达融合蛋白可增强机体对此抗原免疫 能力的效果[14]。增加IL-2的产生，使其高水平表 达从而活化部分T细胞和C T L细胞等其他免疫细 胞.则有助于发挥细胞因子与免疫系统的调节作用，从而使机体产生对HBsAg抗原更强的免疫应答，即对H B V的抵抗力和免疫细胞记忆能力的增强。由于IL-2对免疫细胞的激活作用，只需单独接种1次rBCG即可使机体同时获得对结核分枝杆菌和 H B V的双重抗性，对此我们将在下一步的动物实验 中进行验证。该实验将人/L-2与H B V表面抗原 基因分别扩增后融合，再以新的融合基因 构建重组穿梭表达质粒并电转化导人B C G，使 rBCG成功表达两基因的融合蛋白，为研发既能抵 抗H B V感染又能预防结核分枝杆菌感染的双联疫 苗奠定了坚实的基础。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期=2020-06-10)
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