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一、全球人用疫苗发展概况
二、人用疫苗的研发流程
推进式搅拌桨
拖曳声纳
人用疫苗的研发完全按照新药研发的流程进行，包括临床研究、工艺开发和检定方法研究。临床研究是按照一定程序在人体中进行的疫苗安全性和免疫原性研究，包括临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期试验4个阶段。前3期为疫苗上市前的临床试验，Ⅳ期为疫苗上市后的临床试验。检定方法研究涉及建立全套能够检测原料纯度、疫苗产品稳定性和效力以及通过免疫学和其他标准预测疫苗效力的方法。人用疫苗研发流程见图1。人用疫苗开发的工艺路线见图2
三、人用疫苗的分类及特点
依据是否含有活微生物体，将疫苗分成两大类，即含活微生物体的疫苗（减毒活疫苗、载体 疫苗）和不含活微生物体的疫苗（灭活疫苗、组分疫苗和类毒素疫苗）。灭活疫苗包括全微生物体灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗；组分疫苗包括多核酸疫苗（包括mRNA疫苗和DNA疫苗）、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗、多糖蛋白结合疫苗。
（一）减毒活疫苗
减毒活疫苗是将病原体（细菌、病毒等）经过处理后，使其毒性减弱，接种到机体内，可引发免疫反应，但却不会引发疾病的一种疫苗。生产减毒活疫苗时，选用减毒适宜、毒力低而免疫原性和遗传稳定性均良好的菌、毒种，在敏感培养基（细菌）或适宜动物、鸡胚和细胞培养（病毒）中适应传代以获得较高产量的细菌或病毒，细菌、病毒收获后经过纯化即可。接种减毒疫苗后，病原体在机体内有一定程度的生长繁殖能力，刺激机体产生免疫反应，获得的免疫力较持久，因此接种次数少，受种者反应轻微，但可能出现毒力返祖现象。减毒活疫苗还可能诱导免疫缺陷个体的严重反应。另外，活疫苗的稳定性较差，保存运输较困难，但在制成冻干疫苗后，可增加疫苗稳定性。麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗以及水痘疫苗等都有减毒活疫苗研制。口服脊髓灰质炎疫苗，具体流程见图3 （二）载体疫苗
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载体疫苗是将病原体的保护性抗原基因插入质粒DNA或细菌的基因组，然后使之高效表达而制备的疫苗。载体疫苗在免疫效力上有优势。载体疫苗用量少，无需纯化抗原，接种后刺激机体产生特异性免疫应答，载体可发挥佐剂效应增强免疫效果；比其他制剂具有更强的稳定性和更长的储存期；易于接种，适合于大规模的免疫，免疫途径简单；易大批量生产，成本低。载体通常为特定微生物的疫苗株，如痘苗病毒、腺病毒、卡介苗等。载体疫苗的缺点是机体内针对载体的抗体（免疫前存在的或免疫后产生的）会对相应载体疫苗的再次免疫效果产生一定影响。
制备载体疫苗的载体包括重组细菌载体、重组病毒载体、DNA载体、RNA载体、树突状细胞（dendritic cell，DC）载体、T细胞载体以及多肽载体等（表2）。脂质体（可降解的生物多聚物）、病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）和免疫刺激复合物亦可用于疫苗传递系统。其中活的减毒细菌载体，由于能在接种者体内短期存活以及被运载的表达系统可以继续复制等，可以起到抗原放大效应［12］。开发载体疫苗的基本原理在于其可以刺激MHC-Ⅰ类分子产生细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）反应，同时可以诱导产生针对编码抗原的抗体，不同的载体也可以刺激不同的辅助T细胞成熟［13, 14］。在
选择疫苗载体时，需要考虑载体是否容易操作、载体容纳外源基因的大小、异源蛋白的表达效率、载体的安全性和载体规模化生产的难易。
解放军军事医学科学院将2014年扎伊尔型（Zaire type）埃博拉病毒（Ebola virus，EBoV）糖蛋白（glycoprotein，GP）重组进腺病毒5型（Adenovirus 5，AdV-5）复制缺陷型病毒载体中制备埃博拉病毒病载体疫苗。生产工艺见图4。
（三）灭活疫苗
4d动感座椅灭活疫苗指先培养细菌或病毒，再用化学剂或高温将其灭活而制备的疫苗［17］。狭义的灭活疫苗由整个细菌或病毒组成，广义的灭活疫苗也包括由其裂解片段组成的裂解疫苗，以及将裂解片段进一步纯化得到的亚单位疫苗。
1.全微生物体灭活疫苗：全微生物体灭活疫苗的生产通常选择遗传稳定性和免疫原性良好、抗原性较全的细菌或病毒种，一般毒力较强。需比较研究不同来源菌毒种的生物学性状，包括不同地区、不同时间、不同年龄以及疾病不同严重程度的菌毒种；通过交叉免疫保护水平的比较，选择交叉保护范围广、诱导免疫应答水平高的菌毒种。在遗传稳定性方
面，需对菌毒种进行纯化，如挑选单个菌落或单个病毒空斑，经传代扩增后与原始菌毒种比较，证明二者主要保护区域核苷酸或氨基酸序列的一致性。经比较选择菌毒种后，经培养繁殖或接种于动物、鸡胚、细胞生长繁殖后获得大量的细菌或病毒，以化学灭活剂如福尔马林或β-丙内脂等灭活处理，破坏细菌或病毒的感染性但仍保留其免疫原性［18］。
全微生物体灭活疫苗生产工艺成熟，稳定性高，不具备感染性，在体内无法增殖，较安全；但受种者接种反应较大，免疫力持久力差，一般需要接种2~3次。随着纯化技术在疫苗生产过程中的应用，灭活疫苗随之改进为纯化的灭活疫苗。制备此类疫苗过程中，收获液含各类有机物、无机物、细胞和细胞碎片，需采用各种分离技术去除杂质，对病毒疫苗中含有的宿主细胞蛋白残留量有明确的限度要求。目前使用的灭活疫苗均为纯化疫苗，如狂犬病疫苗、乙型脑炎疫苗和伤寒疫苗等。
国产人二倍体细胞狂犬病疫苗（human diploid cell rabies vaccine，HDCV），利用生物反应器微载体培养人二倍体细胞（human diploid cell，HDC）MRC-5，在MRC-5细胞上接种PM毒株；收获病毒液；超滤浓缩，利用分子筛柱层析纯化疫苗原液；β-丙内酯灭活病毒；配制形成半成品；再分装冻干制成疫苗成品。生物反应器微载体培养技术提高了HDC培养
规模，降低了HDCV批次间的差异，保证了疫苗质量的稳定性和均一性。通过分子筛柱层析进行纯化，可有效去除杂质。此外，国产HDCV对冻干过程中稳定剂和保护剂的组分和冻干工艺进行了优化。国产HDCV热稳定性和效价稳定性良好，质量控制和产品关键指标已处于较高水平，提高了疫苗的免疫效果和安全性，另外短期免疫效果和8年免疫持久性研究结果显示免疫效果良好［19］。从医疗费用方面来看，国产HDCV价格远低于国外HDCV。具体工艺见图5。
2.裂解疫苗：裂解疫苗为多糖疫苗或蛋白疫苗，是对微生物进一步纯化，直至只剩所需抗原成分而产生的。很多侵袭性细菌的表面覆盖一层荚膜，主要成分是多糖。多糖疫苗目标易确定，但免疫原性弱，诱导的保护期限有限，对婴幼儿的免疫原性有限［20］。在脑膜炎球菌疫苗研发历程中，早期开发的是全菌体灭活疫苗，由于接种反应大而终止应用；之后研发脑膜炎球菌多糖疫苗，通过培养A脑膜炎球菌，收取培养物，杀菌，去菌体，纯化制成多糖疫苗，接种多糖疫苗后副作用罕见，对预防控制大龄儿童和成人的相关疾病效果显著，但临床研究发现，年龄<2岁婴幼儿的免疫应答低下甚至缺乏，表明其免疫原性与受种者年龄相关［20］。目前广泛使用的多糖疫苗有23价肺炎球菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗等［20］羟基自由基。
23价肺炎球菌多糖疫苗利用我国地方医院分离出的23个最常见的致病性肺炎链球菌菌株，经过培养提取荚膜多糖、纯化后混合制备而成。23价肺炎球菌多糖疫苗的接种对象为所有>2岁人，接种反应轻微，对高危人保护效果良好，临床研究显示，接种后3周左右可产生保护，保护期一般≥5年［21, 22］，生产工艺见图6。
3.亚单位疫苗：亚单位疫苗是从病原体分离提取具有免疫原性的蛋白组分制成，成分更加单一［24］。疫苗接种是目前预防流感的唯一有效措施，目前广泛使用的季节性流感疫苗包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗以及亚单位疫苗。其中全病毒灭活疫苗接种后不良反应发生率较高，使用逐渐减少；流感病毒亚单位疫苗则由于更好的安全性，应用逐渐增多。亚单位疫苗质量控制标准严格，产品纯度高，临床免疫效果显著，可以提高流感疫苗的安全性，消除了佐剂带来的不良反应，消除了硫柳汞引起的毒副作用，不良反应发生率低。流感全病毒灭活疫苗的接种对象为>12岁人，而流感病毒亚单位疫苗则可用于包括>6个月人。
生产3价流感病毒亚单位疫苗时，采用WHO推荐的流感甲1（H1N1）、甲3（H3N2）和乙型疫苗株（北半球）分别接种鸡胚/细胞培养，收获病毒液经灭活、浓缩、裂解和纯化等工
艺处理后制成。来自鸡胚培养的流感病毒亚单位疫苗的制备包括：病毒接种，病毒增殖培养，尿囊液收获，澄清，超滤浓缩，灭活，裂解和超速离心纯化，凝胶过滤层析纯化（超滤），混配，过滤除菌，分装，包装等［25, 26］，生产工艺见图7。
四）组分疫苗
组分疫苗是指将致病病原体主要的保护性免疫原组分制成的疫苗，包括核酸疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗等。
账本网1.多肽疫苗：多肽疫苗即根据病毒的氨基酸序列合成的一段多肽生产的疫苗，是用化学合成法合成类似于抗原决定簇的小肽（约20~40个氨基酸），最早的研究为口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）的单独B细胞抗原表位或与T细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究［28］。全球仅有一款多肽疫苗已上市，即2011年获批上市的古巴的Cimavax-EGF疫苗，用于ⅢB期、Ⅳ期非小细胞肺癌的性疫苗，Ⅲ期临床显示能将受试者5年生存期提高近1倍至14.4%（对照组为7.9%）［29］。
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