膜蛋白是一种位于细胞膜上的蛋白，主要分为外周膜蛋白和跨膜蛋白两大类。膜蛋白具有重要的生物功能，如控制能量转换、参与信号转导、控制物质运输、维持细胞和组织结构等，因此膜蛋白一直是研究热门，是当前近70%的药物靶标。 想要研究更具体膜蛋白结构或者功能特性，我们首先要提取纯化相应的膜蛋白。接下来以一篇经典Nature文章为例，解析如何提取纯化膜蛋白。超前止水后浇带
2019年Nature文章：人的T cell receptor–CD3 复合体结构研究
纯化思路：
共沸精馏（1）重组蛋白的构建：
以哺乳细胞HEK293F为表达宿主，在C末端依次加了Strep和His标签。 目的基因：TCRα，TCRβ（pCAG)+CD3γ、δ、ε、ζ（pcDNA3,4）。
（2）重组蛋白的诱导表达：
在37℃、含有5%CO2条件下，120 rpm 培养60 h。
（3）细胞膜结构的制备和溶解：
通过离心收集细胞，然后匀浆破碎。
细胞膜结构组份的收集：用25 mM HEPES，pH 7.5,1 M NaCl缓冲溶液重悬，加入1mM PMSF，100,000g超速离心30 min收集细胞膜结构组份。
细胞膜结构的溶解：用25 mM HEPES，pH 7.5,150 mMNaCl，1% DDM，0.2% cholesteryl hemisuccinate tris salt, 1 mM PMSF, 4℃条件下溶解2 h。
40,000g 离心30 min，收集上清，即为可溶的膜蛋白粗溶液。
（4）亲和层析纯化：
本文作者用StrepTactin 填料进行纯化。
结合条件：4℃结合3 h；
Wash buffer: 25 mM HEPES，pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.06% digitonin;
Elution buffer: 25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.06% digitonin+4 mM desthiobiotin无人机机巢
图1 亲和层析后，各个亚基的SDS-PAGE图
（5）膜蛋白复合体交联
蛋白质浓缩后用0.1%(v/v)的戊二醛交联40min，得到膜蛋白复合体。
（6）凝胶过滤分子筛层析：
用Superose 6 increase 10/300, buffer为25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.06% digitonin
图2 TCR-CD3复合体SDS-PAGE图
膜蛋白复合体TCR-CD3交联后进行凝胶过滤分子筛层析，进行SDS-PAGE实验，发现得到比较纯的复合体。
（7）TCR-CD3结构分析
通过冷冻电镜分析，TCR–CD3复合物的最终原子模型包含全长TCRαβ的亚基，完整的ECD和跨膜螺旋CD3γε，CD3δε和CD3ζζ
图3 TCR–CD3复合体结构图
看完大佬的实验框架，是不是顿时对自己的实验也有了一些思路？
电梯制动器总结一下，膜蛋白的一般研究流程：
蓝背景分别是表达系统与去垢剂的选择，是整个流程中至关重要的步骤。
膜蛋白的表达系统：原核表达（大肠杆菌、红杆菌属）、哺乳细胞（HEK293F）、酵母表达、昆虫细胞表达。不同的表达系统的优缺点见下图。
去垢剂的选择：去垢剂别名表面活性剂、乳化剂、肥皂等等，分为离子型、非离子型和两性离子型三类。去垢剂是同时具有亲水性和疏水性基团的双极性分子，能够使磷脂双分子层解体并释放膜蛋白，并且为去膜状态下的膜蛋白提供稳定的疏水环境。去垢剂也需要筛选合适的种类和浓度，各自优缺点见下图。
蛋白纯化：使用亲和+凝胶过滤（分子筛）即可完成膜蛋白的纯化流程。膜蛋白纯化由于含有去垢剂的存在，离子交换不作为第一选择。等温正火退火炉
温度远程监控操作TIPS
一、膜蛋白分离
1、膜蛋白的内源表达通常来说是比较低的，如果要提高产量可以通过重组膜蛋白的过表达，可以选择大肠杆菌，酵母，哺乳动物或者无细胞表达体系。然而，外源表达的翻译后修饰例如糖基化，磷酸化和乙酰化和天然蛋白的不同可能会导致重组蛋白的某些活性下降（原核表达没有翻译后修饰系统），可以考虑通过对组成修饰的氨基酸进行位点突变来改善。
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